外源雄激素通过AR-Foxl3-Rec8/Fbxo47轴调控斜带石斑鱼精巢发育的离体研究

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斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)是雌雄同体雌性先熟的鱼类,是研究性腺分化、性别决定和性逆转机制的理想模型,也是一种具有较高营养价值的海水养殖鱼类。AR(Androgen receptor,AR)是雄激素受体,雄激素通过其在脊椎动物生殖系统中起关键作用,以调节性腺的分化和发育。Forkhead box L 3(foxl3)是foxl2的同源基因,研究表明foxl3对鱼类的精巢发育有重要的影响。rec8和fbxo47基因参与减数分裂,且会影响精子的发生、发育以及成熟等。在斜带石斑鱼中,雄激素可以促进性腺发生性逆转,以及精巢的发育和精子的发生,但是,雄激素如何影响精巢的发育途径尚不清楚。本文利用实时定量PCR方法对rec8和fbxo47基因在不同组织器官中的表达量进行检测;以及对foxl3、rec8和fbxo47基因在10个不同发育阶段性腺中的表达量进行检测;并利用双荧光素酶的方法对AR转录因子与foxl3启动子、Foxl3转录因子与rec8/fbxo47启动子的活性进行检测;此外利用亚细胞定位对foxl3、rec8和fbxo47基因在GS(Grouper spleen)细胞中的表达进行定位。实验结果如下:1.fbxo47的开放阅读框(ORF)1425bp,编码414个氨基酸。rec8的开放阅读框含有1752bp,编码513个氨基酸。通过实时荧光定量对rec8和fbxo47 m RNA的差异性表达进行检测分析,结果表明,rec8和fbxo47基因在斜带石斑鱼的头肾、性腺、肌肉、皮肤、大脑、鳃等组织中均有表达且表达量存在差异,且在性腺中表达量最高。此外,通过参考文献以及性腺切片来确定斜带石斑鱼性腺发育情况,收取不同发育阶段的性腺组织(孵化后70天、90天、110天、180天,以及O2、O3、O4、兼性和精巢)。从O2到精巢,实时荧光定量表明fox13、rec8和fbxo47随着性腺的发育,表达量逐渐增加,且在精巢达到最大值,其次是兼性;foxl3、rec8和fbxo47在兼性和精巢的表达量是O4期卵巢的7-10倍、29-188倍以及11-320倍,这表明foxl3、rec8和fbxo47可能与斜带石斑鱼精巢的发育有关。2.foxl3、fbxo47和rec8基因在GS的亚细胞定位表明,foxl3在细胞核中表达,fbxo47在细胞核周边中表达,而rec8在细胞质中表达。3.同时,双荧光素酶结果显示,AR可以增强PGL4.10-foxl3启动子活性,而且Foxl3可以上调PGL4.10-rec8和PGL4.10-fbxo47启动子活性,其启动子活性先升高后降到与对照组一致的水平。AR和PGL4.10-foxl3或Foxl3和PGL4.10-rec8在20ng时,双萤光素酶活性极显著(p<0.001),而Foxl3和PGL4.10-fbxo47在50ng时双荧光素酶活性极显著(p<0.001)。用β-testosterone(10、50、100、200n M)处理后,PGL4.10-fox13、PGL4.10-rec8和PGL4.10-fbxo47启动子活性显著增强(P<0.05),活性先升高后降低。PGL4.10-foxl3和PGL4.10-rec8在50n M活性达到最大值,而PGL4.10-fbxo47在100n M活性达到最高值(p<0.001)。结果表明,foxl3、rec8和fbxo47随着斜带石斑鱼性腺的发育,其表达量也随之增加,在精巢中表达量最高。且foxl3通过调控rec8和fbxo47表达,来影响斜带石斑鱼精巢发育,并推测AR-Fox13-Rec8/Fbxo47轴是雄激素影响斜带石斑鱼精巢发育的途径。揭示AR-Fox13-Rec8/Fbxo47轴中的相关基因的表达量以及调控机理,为进一步开展斜带石斑鱼分子生物学研究和指导养殖生产提供理论指导。
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