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目的:哺乳动物生殖细胞发育是一个极其复杂且精细的程序。在正常情况下,哺乳动物生殖细胞特别是卵母细胞的发育过程主要包括配子发生,转移,受精和宫内发育。在此过程中,任何异常都可能影响个体的生殖能力,并导致不孕不育。卵母细胞发育和成熟是影响胚胎健康的关键步骤。当卵母细胞生长到成熟体积的80%时,它就获得了恢复减数分裂的能力。此时,卵母细胞核大,染色质高度疏松并且核膜完整,称为生发泡（germinal vesicle,GV）。如果完全成熟的卵母细胞失去了对卵泡的控制,就会自发发生减数分裂,这被称为生发泡破裂（germinal vesicle breakdown,GVBD）。GVBD发生后,卵母细胞完成第一次减数分裂,同源染色体分离,第一极体排出。随后,纺锤体重新组装,卵母细胞进入二次减数分裂中期（Metaphase II,MII）,直到受精。GVBD的发生对卵母细胞成熟影响较大,也是目前卵母细胞体外成熟调控影响因素研究的重点之一。钙离子作为细胞内的第二信使,在细胞周期调节中发挥重要作用,而钙结合蛋白（calcium binding proteins,CBP）对于钙离子发挥关键的第二信使的作用至关重要。CABS1（calcium binding protein,spermatid-associated 1）是一种新型的钙结合蛋白,最初发现它与大鼠精子发生过程中的减数分裂有关并且可以被酪蛋白激酶2磷酸化,另有研究报告其在小鼠精子细胞中有表达。最近,CABS1也被报道在唾液中有表达并且具有抗炎作用。但其是否影响卵母细胞减数分裂恢复尚未被研究。我们之前的研究显示钙调蛋白（Calmodulin,Ca M）和3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate,PIP3）可以一起结合蛋白激酶B（protein kinase B,PKB/Akt）的PH结构域,协同促进钙信号传导,而且蛋白磷酸酶Cδ（Protein kinase Cδ,PKCδ）和钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（calmodulin dependent protein kinase II,Ca MKII）可以通过Akt参与小鼠卵母细胞双线期阻滞和释放的调控。在此基础上,我们研究了CABS1在小鼠卵巢以及在卵母细胞不同发育时期表达情况,并且初步探索了PKCδ和Ca M是否参与了CABS1对于小鼠卵母细胞减数分裂恢复的过程。研究方法:1、本研究首先取C57BL/6小鼠子宫,输卵管和卵巢组织,通过Real-Time PCR分析CABS1的m RNA表达;随后再取小鼠子宫,输卵管和卵巢组织,通过Western Blotting分析CABS1的蛋白表达。2、分别培养和收集GV期卵母细胞、GVBD期卵母细胞、MI期卵母细胞及MII期卵母细胞,通过Western Blotting分析CABS1在卵母细胞在不同发育时期的蛋白表达情况;分别培养和收集GV期卵母细胞、GVBD期卵母细胞、MI期卵母细胞及MII期卵母细胞,通过细胞免疫荧光分析CABS1在卵母细胞在不同发育时期的定位情况。3、收集GV期卵母细胞并且使用PKCδ抑制剂Sotrastaurin来处理细胞,比较对照组和抑制剂组卵母细胞发生GVBD的百分率,同时通过Western Blotting检测对照组和抑制组卵母细胞CABS1的蛋白表达,通过细胞免疫荧光检测对照组和抑制剂组卵母细胞的定位情况,以此明确PKCδ是否参与CABS1对小鼠卵母细胞减数分裂恢复的调控。4、收集GV期卵母细胞并且使用Ca M抑制剂Calmidazolium chloride来处理细胞,比较对照组和抑制剂组卵母细胞发生GVBD的百分比,同时通过Western Blotting检测对照组和抑制组卵母细胞CABS1的蛋白表达,再通过细胞免疫荧光检测对照组和抑制剂组卵母细胞的定位情况,以此明确Ca M是否参与CABS1对小鼠卵母细胞减数分裂恢复的调控。结果:1、组织学检测:Real-Time PCR结果显示,CABS1在子宫中表达最多,在卵巢中表达较少,在输卵管中几乎没有表达。与m RNA的表达水平一致,CABS1的蛋白表达量在子宫中最高,其次是卵巢,最后是输卵管。2、卵母细胞体外研究:Western Blotting结果显示,CABS1在GV期表达最少,这可能是卵巢低蛋白表达的原因,且GVBD期CABS1的表达量约为GV期的两倍（P＜0.05）。同时,MI和MII期CABS1的表达显著高于GV和GVBD期。细胞免疫荧光结果显示CABS1主要分布于各时期的细胞质膜,特别是细胞膜。3、Western Blotting结果显示,与未处理组相比,CABS1的蛋白表达随着抑制剂浓度的增加而显著降低。用10μM Sotrastaurin处理时,CABS1的表达减少了约一半（P＜0.05）,用100μM Sotrastaurin处理时,CABS1的蛋白表达极低,这表明PKCδ可能参与了CABS1的调控。免疫荧光结果显示,随着抑制剂浓度增加,卵母细胞的形状由卵形逐渐转变为不规则形,100μM浓度下卵母细胞明显萎缩。4、Western Blotting分析显示,加入抑制剂Calmidazolium chloride后,CABS1的表达下降,但随着浓度的增加,抑制作用并没有明显增强。免疫荧光分析表明,随着抑制剂浓度的增加,卵母细胞逐渐缩小,用10μM Calmidazolium chloride处理时卵母细胞略有缩小,用100μM Calmidazolium chloride处理时卵母细胞明显缩小,CABS1仍主要分布在细胞质膜上。结论:本项研究中,我们发现尽管CABS1在卵巢中的表达量并不高,但与GV期相比,在GVBD、MI和MII期CABS1的表达量明显增加,尤其是MI和MII期。当使用Sotrastaurin（PKCδ的抑制剂）和Calmidazolium chloride（Ca M的抑制剂）后,CABS1蛋白表达水平明显降低并且卵母细胞生长受到了抑制,因此PKCδ和Ca M可能参加了CABS1在小鼠卵母细胞减数分裂恢复的调控。