β-伴大豆球蛋白是引起大豆食物过敏反应的蛋白质之一,为含有α、α’、β三个亚基的共轭三聚体,且三个亚基均具有致敏性。目前关于β-伴大豆球蛋白的研究报道中,有关α’亚基的研究较少。本研究通过生物信息学技术对β-伴大豆球蛋白α’亚基进行分析预测并对其进行overlapping（重叠）分段,利用PCR技术、T载体克隆、噬菌体展示技术得到噬菌体展示的含有目的片段的蛋白,将β-伴大豆球蛋白制备的兔抗血清、超高压处理抗原吸收的兔抗血清、热加工处理抗原吸收的兔抗血清作为一抗与噬菌体展示蛋白进行ELISA反应,筛选被加工破坏的抗原表位,经过三轮overlapping分段定位出被加工破坏的抗原表位。利用定位的被加工破坏的抗原表位的氨基酸序列合成多肽,通过Dot-blot和ELISA方法检测偶联多肽与β-伴大豆球蛋白制备的兔抗血清、超高压处理抗原吸收兔抗血清、热处理抗原吸收兔抗血清的反应,偶联多肽能够与β-伴大豆球蛋白制备的兔抗血清发生反应,不与被加工破坏抗原吸收的兔抗血清反应,说明该抗原表位可能既含有线性位点又含有构象性位点;该抗原表位的噬菌体展示蛋白既能与β-伴大豆球蛋白制备的兔抗血清反应,又能与被加工破坏抗原吸收的兔抗血清反应,说明超高压和热处理两种加工方法破坏了该抗原表位中的构象性位点,但是没有破坏线性位点。最后通过将12个大豆过敏患者的混合血清作为一抗的ELISA方法确认该抗原表位具有致敏性。本研究结果对β-伴大豆球蛋白α’亚基的研究、正确指导安全食品的加工、防止食品过敏性疾病的发生具有重大意义。本研究的主要内容如下:1.利用生物信息学技术对β-伴大豆球蛋白α’亚基进行分析和预测,根据预测结果进行overlapping分段和引物设计。运用PCR技术、T载体克隆、噬菌体展示技术获得需要的重组质粒T-Q、T-A、T-B、T-C和噬菌体展示蛋白Pt-Q、Pt-A、Pt-B、Pt-C。利用酶联免疫方法检测可知:噬菌体展示蛋白Pt-C的抗原性最强,超高压和热处理两种加工方式对Pt-C的破坏最强。2.运用生物信息学技术对β-伴大豆球蛋白α’亚基片段C进行进一步的分析和overlapping分段——片段C1、C2、C3,使用PCR技术、T载体克隆、噬菌体展示技术和酶联免疫方法对片段C的overlapping分段进行克隆载体的构建和噬菌体蛋白的表达、纯化及鉴定。所得结论为:噬菌体表达蛋白Pt-C1的抗原性高于其他两个蛋白,热加工处理对Pt-C1抗原性的破坏较强,超高压处理对Pt-C3的抗原性破坏较强,并且热处理对Pt-C1抗原性的破坏程度高于超高压对Pt-C3的破坏程度。选择被加工破坏更严重的抗原Pt-C1进行下一步的鉴定。3.利用生物信息学技术、PCR技术、T载体克隆、噬菌体展示技术和酶联免疫方法对β-伴大豆球蛋白α’亚基片段C1进行分析和overlapping分段、对片段C1的overlapping分段进行克隆载体的构建和噬菌体蛋白的表达、纯化和鉴定。利用ELISA方法鉴定噬菌体表达蛋白Pt-C1-Y的抗原性最强,超高压处理对Pt-C1-X的抗原性破坏更强,热加工处理对Pt-C1-Y抗原性的破坏更强,热处理对Pt-C1-Y抗原性的破坏程度高于超高压对Pt-C1-X的破坏程度。选择能更好被加工破坏的Pt-C1-Y进行进一步的研究,将Pt-C1-Y的氨基酸序列合成多肽。4.合成多肽（C）PHFNSKAIVVLVINEGEANIELVG、多肽1、2、3与BSA偶联,用SDS-PAGE方法确认多肽偶联成功,并利用Dot-blot方法发现BSA-Pep-Y、BSA-Pep-1、BSA-Pep-2能够被β-伴大豆球蛋白制备的多克隆抗体识别,而BSA-Pep-3不与β-伴大豆球蛋白制备的多克隆抗体反应,说明该片段可能具有β-伴大豆球蛋白的线性结合位点;通过ELISA鉴定发现BSA-Pep-Y、BSA-Pep-1、BSA-Pep-2、BSA-Pep-3都不与加工处理蛋白吸收血清反应,进一步说明该片段具有β-伴大豆球蛋白的线性结合位点而且没有被加工处理破坏。但是,噬菌体展示蛋白Pt-C1-Y既能和β-伴大豆球蛋白制备的多克隆抗体反应又能和加工处理蛋白吸收的兔抗血清反应,说明该抗原表位可能为含有部分线性位点的构象性表位。将12个大豆过敏患者的混合血清作为ELISA中的一抗,鉴定噬菌体展示蛋白Pt-C1-Y、偶联多肽BSA-Pep-Y、BSA-Pep-1、BSA-Pep-2、BSA-Pep-3的致敏性:Pt-C1-Y能够与大豆过敏患者的混合血清反应,但是BSA-Pep-Y、BSA-Pep-1、BSA-Pep-2、BSA-Pep-3无反应,说明蛋白Pt-C1-Y具有致敏性,而BSA-Pep-Y、BSA-Pep-1、BSA-Pep-2、BSA-Pep-3不具有致敏性。