【摘 要】
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【目的】探讨高位和低位隐睾患儿的睾丸引带在组织构成及基因表达谱的差异;探讨两组组织中细胞组分的差异及其生物学特性、研究外源性雌激素己烯雌酚对两组引带细胞的生物学特性的影响。其结果可以加深对人类睾丸下降中睾丸引带作用及外源性雌激素影响的理解。【方法】收集隐睾患儿术中废弃的睾丸引带。以麻醉下未降睾丸的位置位于内环口以上的腹腔型隐睾为高位组,以已出内环口但未出外环口的腹股沟管型隐睾为低位组,分别进行组织
【基金项目】
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国家自然科学基金(81270742,81370700,81470911); 上海市卫计委重点课题(201540389); 上海市重大疾病临床生物样本实体库专业技术服务平台(15DZ2292100);
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【目的】探讨高位和低位隐睾患儿的睾丸引带在组织构成及基因表达谱的差异;探讨两组组织中细胞组分的差异及其生物学特性、研究外源性雌激素己烯雌酚对两组引带细胞的生物学特性的影响。其结果可以加深对人类睾丸下降中睾丸引带作用及外源性雌激素影响的理解。【方法】收集隐睾患儿术中废弃的睾丸引带。以麻醉下未降睾丸的位置位于内环口以上的腹腔型隐睾为高位组,以已出内环口但未出外环口的腹股沟管型隐睾为低位组,分别进行组织切片染色观察其组织构成;分别选取高低位组引带组织各3例进行表达谱芯片检测,对组间差异表达的基因进行Gene Ontology及Pathway分析;两组引带分别用IV型胶原酶消化、原代培养并对细胞的生物学特性进行鉴定,检测ACTA1、MYH11、FSP1、RXFP2及AR相关基因的表达差异;根据原代细胞培养是否有肌管细胞形成将低位组分为低位组1(无肌管细胞)和低位组2(有肌管细胞),将高位组与低位组2细胞分别培养于溶剂对照组(DMSO)和DES浓度梯度为0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml及10.00μg/ml培养基(实验组),并分别与完全培养基(空白对照组)比较,观察两组细胞DES刺激前后的形态学改变、增殖能力和ACTA1、MYH11、FSP1、RXFP2及AR相关基因表达水平变化。【结果】1.本实验高位组招募10例患儿,平均年龄为1.24+0.24岁;低位组招募25例患儿;平均年龄为1.29+0.40岁;两组年龄比较无显著性差异。2.组织切片染色结果:在高位组(n=7)引带中均未发现肌肉样结构,低位组(n=22)均观察到横纹肌,其总体横纹肌面积比例为8.19+3.67%。3.高位(n=3)与低位(n=3)隐睾睾丸引带基因表达谱芯片检测结果:表达差异的基因共有96个(P<0.05,fc>2)。其中高位组较低位组上调的基因60个,下调的基因36个;GO富集分析发现其中有5个差异表达的基因与调节肌肉系统生物过程相关(其中高位组比低位组上调的基因有4个,为PTGS2、ERRFI1、CMYA5和ANK2,其上调倍数分别为16.75、6.05、2.92和2.25倍;下调的一个基因为HSPB6,其下调倍数为2.22倍);KEGG分析发现两组间组类固醇激素生物合成等生物学通路存在显著差异。4.原代细胞培养及检测结果:高位组7例患儿成功培养出5例、低位组22例患儿成功培养出16例;两组细胞光镜下呈现成纤维细胞样形态,低位组中有6例细胞传代后可见肌管样细胞形成、这6例肌管样细胞平均数目比例约为11.61+5.09%,5例高位组均未观察到肌管样细胞形成;分别检测相关基因表达量,发现成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1)表达量在各组未见明显差异,有肌管细胞形成的低位组2细胞的肌性相关基因骨骼肌型肌动蛋白基因1(ACTA1)及平滑肌肌球蛋白重链11(MYH11)的表达均高于高位组及无肌管细胞形成的低位组1,高位组激素受体相关基因包括松弛素/胰岛素样家族肽受体2(RXFP2)及雄激素受体(AR)表达均高于低位组,差异均有统计学意义。5.选取人类高位组(n=3)和低位组2(n=3)隐睾睾丸引带细胞经浓度梯度DES刺激后发现高浓度DES(10μg/ml)可抑制两组细胞的增殖活力均(差异有统计学意义)、改变细胞的光镜形态和微丝骨架,但是其对两组细胞的增殖抑制及形态改变没有统计学差异。随着作用时间的延长,两组细胞增殖的活力虽然均有下降趋势,但其差异无统计学意义。己烯雌酚可下调高位组AR表达水平、上调其ESR及RXFP2表达水平;并上调低位组2的RXFP2表达水平。【结论】1.人类隐睾睾丸引带组织内的肌肉成分与其位置相关,高位隐睾睾丸引带未见肌肉成分、低位隐睾睾丸引带中存在横纹肌。2.人类高低位隐睾引带的表达谱芯片结果显示两组存在与调节肌肉系统生物过程相关的PTGS2、ERRFI1、CMYA5、ANK2和HSPB6差异表达基因,两组间类固醇激素生物合成等生物学通路存在显著差异,具体机制有待后续进一步验证。3.人类隐睾睾丸引带细胞培养发现高位及低位的细胞形态及相关基因ACTA1、MYH11、RXFP2和AR表达存在显著差异,部分低位组引带细胞可分化为肌管样细胞。4.高浓度外源性雌激素DES可改变培养的高低位隐睾睾丸引带细胞骨架并导致细胞增殖活力的抑制,其对两组细胞均有毒性作用。
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