【摘 要】
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[目 的]本研究以我国HIV-1感染的长期不进展者为研究样本,从中分选靶向HIV-1的中和抗体并分析其可变区序列特征和功能活性。随后通过基因工程技术将分选的中和抗体改造为IgM形式。了解改造后的IgM抗体亲和力和中和活性的改变。探索IgM类抗体在HIV-1被动免疫治疗领域中的应用价值和范围。为诱导保护性IgM抗体为目标的疫苗提供一定的理论基础,为艾滋病的防治提供新的思路。[方 法]（1）采用单个记
【基金项目】
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云南省卫生健康委员会医学学科带头人培养计划（D-2018025）；
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[目 的]本研究以我国HIV-1感染的长期不进展者为研究样本,从中分选靶向HIV-1的中和抗体并分析其可变区序列特征和功能活性。随后通过基因工程技术将分选的中和抗体改造为IgM形式。了解改造后的IgM抗体亲和力和中和活性的改变。探索IgM类抗体在HIV-1被动免疫治疗领域中的应用价值和范围。为诱导保护性IgM抗体为目标的疫苗提供一定的理论基础,为艾滋病的防治提供新的思路。[方 法]（1）采用单个记忆B细胞流式分选的方法,进行HIV-1特异性中和抗体的分选和特征鉴定。针对候选样本分选得到的HIV-1特异性单个记忆B细胞进行逆转录PCR、巢式PCR扩增抗体轻、重链可变区的基因序列并插入到表达载体中。挑选基因序列具有特征的抗体在293T和293F细胞中进行表达,采用重组protein A进行纯化。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）初步鉴定其分子量大小和结合功能。（2）选择具有一定结合活性的抗体将其改造为IgM形式,在293T和CHO-S细胞中进行表达,采用IgM focurose 6HP层析柱进行纯化。通过微量热涌动（Microscale thermophoresis,MST）实验和中和实验检测同一抗体IgG和IgM形式亲和力大小和中和活性的差异。[结 果]（1）分选得到单个记忆B细胞,并扩增获得98对抗体基因序列。其中重链来源于4个胚系基因,分别为IGHV1-2、IGHV1-69、IGHV3-30和 IGHV3-15,体细胞高频突变（somatic hypermutation,SHM）水平为 2.4%-32.4%。轻链来源于4个胚系基因,分别为IGLV3-19、IGLV1-44、IGKV1-5和IGKV3-11,SHM水平为3.6%-27.9%。（2）4个分选抗体在293T细胞上清中分泌表达,分别为2C5、2E8、3C10和3D9。（3）SHM水平相对较高的2E8抗体在293F细胞上清中表达并纯化。ELISA初步鉴定其抗原结合能力并与本课题组前期分选抗体7D5相比,7D5的结合能力强于2E8。（4）对2E8和7D5进行IgM改造,构建IgM表达质粒。并在293T细胞中成功表达。（5）IgM-2E8和IgM-7D5在CHO-S细胞培养上清中表达并纯化。（6）对同一抗体的IgG和IgM形式的亲和力进行比较。IgM-2E8亲和力有近10倍的提升,而IgM-7D5的亲和力也有近两倍的提升。（7）对同一抗体的IgG和IgM形式的中和活性进行比较,IgM-2E8和IgM-7D5对HIV-1假病毒398F1和246F3的中和活性均有近2倍的提升。[结 论]分选获得了靶向HIV-1的中和抗体,对其序列特征分析提示高水平的体细胞超突变可能会影响抗体的亲和力和中和活性。IgM改造后的中和抗体不仅提高了抗体的亲和力,同时间接提高了抗体的中和活性,为HIV-1的预防和疫苗开发提供更多的策略。
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