背景与目的:胃癌（gastric cancer,GC）是消化道最常见的恶性肿瘤之一。我国胃癌的发病率和死亡率均居中国恶性肿瘤的第二位,且发病率尚未见下降趋势。据我国关于胃癌的流行病学统计资料显示,约30-40%的胃癌患者在就诊时病期已较晚,5年生存率不足10%。尽管随着治疗方案的优化和新的靶向药、免疫治疗的出现,晚期胃癌患者的生存得到了一定程度的改善。但是总体来说,目前我国胃癌的诊断和治疗情况仍不太乐观,早期诊断率低,针对晚期胃癌尚缺乏有效的预测及治疗手段。我国胃癌的防治工作仍面临着严峻的形式。因而,明确胃癌的发生发展及侵袭和转移机制,进而找到新的有效的治疗靶点迫在眉睫。WASF3在肿瘤的侵袭和转移中起着重要作用。然而,WASF3在胃癌的作用以及其作用机制尚不清楚。本研究旨在了解WASF3在胃癌中的表达及其临床意义,研究WASF3对胃癌细胞生物学行为的影响,探讨WASF3调控胃癌细胞生物学行为的分子机制,并对WASF3影响胃癌细胞对奥沙利铂化疗敏感性的可能机制进行初步探讨。以期为探索新的胃癌治疗靶点和临床转化提供一定的理论依据。本研究共分为四个部分。第一部分WASF3在胃癌中的表达及其临床意义研究目的:通过收集临床资料,分析WASF3与胃癌分子病理特征及预后的关系,了解WASF3在胃癌中表达的临床意义。研究方法:1、回顾性收集118例经病理确诊的胃癌组织标本和癌旁组织标本,收并集46例经病理确诊的新鲜胃癌组织和癌旁组织标本;2、应用q PCR的方法分析新鲜胃癌组织和癌旁组织标本中WASF3和E-cadherin的m RNA的表达;3、应用免疫组化的方法分析回顾性标本中胃癌组织和癌旁组织中WASF3和E-cadherin的蛋白表达;4、统计学分析WASF3与胃癌分子病理特征及预后的关系,并分析WASF3与E-cadherin之间的关系。研究结果:1、在46例新鲜组织标本中,WASF3在胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,而E-cadherin在胃癌组织中的表达水平低于癌旁组织,两组之间的差异有统计学意义（p＜0.05）;2、免疫组化结果显示,WASF3主要在胞浆表达,而E-cadherin主要表达在细胞膜,WASF3表达阳性与淋巴结转移、脉管癌栓以及TNM分期显著相关（p＜0.001）,E-cadherin表达缺失与淋巴结转移和脉管侵犯有关（P值分别为0.024和＜0.001）;3、有28例患者（23.7%）同时表现为WASF3阳性表达和E-cadherin表达缺失,WASF3阳性表达与E-cadherin表达缺失是呈相关性;4、生存分析发现,WASF3表达阳性的患者的预后比WASF3表达阴性的患者差（P＜0.001）。而E-cadherin的表达状态与胃癌患者的生存无相关性;5、在56例WASF3表达阳性的胃癌患者中,用含奥沙利铂方案治疗的患者预后较差,而不用含奥沙利铂的方案治疗的患者预后较好,两组之间有显著性差异（p=0.032）;6、单因素结果显示,脉管癌栓、淋巴结转移、TNM分期、WASF3的表达状态与胃癌的生存显著相关（p＜0.001）,多因素分析提示,WASF3表达状态是胃癌生存的独立预后因素（P=0.027）。研究结论:WASF3在胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。WASF3高表达与淋巴结转移和血管侵犯有关。WASF3高表达预示胃癌患者预后更差,对含奥沙利铂方案治疗不敏感。第二部分WASF3对胃癌细胞生物学行为的影响研究目的:探讨抑制或过表达WASF3对胃癌细胞生长增殖、侵袭和迁移等生物学行为的影响。研究方法:1、应用q PCR和Western blot方法分别检测四种胃癌细胞在m RNA和蛋白水平中WASF3和E-cadherin的表达情况,分别选取高表达WASF3和低表达WASF3的两种胃癌细胞进行后续的细胞实验;2、利用慢病毒包装的WASF3-sh RNA质粒感染并构建WASF3表达稳定受到抑制的胃癌细胞;用慢病毒LV-WASF3感染并构建WASF3稳定过表达的胃癌细胞;3、应用CCK8法和平板克隆形成实验检测WASF3对胃癌细胞生长增殖的影响;4、应用细胞划痕实验和Transwell小室侵袭模型实验检测WASF3对胃癌细胞侵袭和迁移的影响;5、利用裸鼠移植瘤模型检测WASF3与胃癌细胞在体内生长能力的关系。研究结果:1、q PCR和Western blot法检测WASF3和E-cadherin在四种胃癌细胞系SGC7901、MGC803、BGC823、MKN45中的表达情况,WASF3在SGC7901和MGC803细胞中表达水平相对较高,在BGC823和MKN45细胞中的表达水平较低,而E-cadherin在SGC7901和MGC803细胞中这两种细胞中的表达水平相对较低,在BGC823和MKN45细胞中的表达水平较高（p＜0.05）,我们选用MGC803和MKN45细胞进行后续实验;2、成功构建了WASF3稳定低表达的MGC803细胞（MGC803+sh WASF3）,并成功构建了WASF3稳定过表达的MKN45细胞（MKN45+oe WASF3）;3、CCK-8和平板克隆形成实验结果表明,抑制WASF3的表达后,胃癌MGC-803细胞的生长和增殖较对照组明显受到抑制,差异有统计学意义（p＜0.05）;使WASF3过表达后,胃癌MKN45细胞的生长和增殖较对照组明显增强,差异有统计学意义（p＜0.05）;4、细胞划痕实验和Traswell小室侵袭模型实验结果表明,抑制WASF3的表达后,胃癌MGC-803细胞的迁移和侵袭能力较对照组明显受到抑制,两组之间的差异有统计学意义（p＜0.05）;使WASF3过表达后,胃癌MKN45细胞的迁移和侵袭能力较对照组明显增强,两组之间的差异有统计学意义（p＜0.05）;4、裸鼠移植瘤模型结果显示,sh WASF3组裸鼠移植瘤瘤体的体积小于对照组,肿瘤的湿重也小于对照组,两组之间的差异有统计学意义（p＜0.05）;而oe WASF3组裸鼠移植瘤瘤体的体积大于较对照组,肿瘤的湿重也大于对照组,两组之间的差异有统计学意义（p＜0.05）。研究结论:WASF3能够促进胃癌细胞在体外和体内的生长及增殖,并能够促进胃癌细胞的侵袭和迁移。第三部分WASF3通过与P85相互作用调控PI3K/AKT/NFκB信号通路研究目的:探讨WASF3促进胃癌细胞生长增殖和侵袭迁移的分子机制。研究方法:1、抑制或过表达WASF3后,利用Western blot的方法检测胃癌细胞中PI3K信号通路中重要的分子p85以及下游的激酶p-AKT,p-NFκB,效应分子EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、ICAM-1的表达情况;2、利用免疫共沉淀验证WASF3是否与p85存在相互作用;3、通过慢病毒包装的质粒感染并构建WASF3低表达p85过表达的稳转胃癌MGC803细胞（MGC803+sh WASF3+oep85）,同时构建WASF3过表达p85低表达的胃癌MKN45细胞（MKN45+oe WASF3+shp85）;4、利用CCK8和平板克隆形成实验检测WASF3促进胃癌细胞生长增殖是否依赖于p85;5、利用细胞划痕实验和Transwell小室侵袭模型实验检测WASF3促进胃癌细胞迁移和侵袭是否也依赖于p85;6、利用Western blot的方法检测了解WASF3调控PI3K/AKT/NFκB信号通路是否依赖于p85;7、利用免疫共沉淀初步探讨WASF3与p85相互作用的可能机制。研究结果:1、Western blot结果表明,抑制WASF3的表达后,p85、p-AKT、p-NFκB的表达水平均较对照组下降,效应分子EMT相关蛋白E-cadherin的表达水平较对照组升高,而N-cadherin、ICAM-1的表达均较对照组下降,AKT,NFκB总蛋白较对照组无明显变化;使WASF3过表达后,上述各信号通路蛋白的表达水平相反;2、免疫共沉淀结果揭示了WASF3与p85之间存在相互作用;3、成功构建WASF3低表达p85过表达的稳转胃癌MGC803细胞（MGC803+sh WASF3+oep85）和WASF3过表达p85低表达的胃癌MKN45细胞（MKN45+oe WASF3+shp85）;4、CCK8和平板克隆形成实验显示,同时调控WASF3和p85的表达后,MGC803+sh WASF3+oep85组和MKN45+oe WASF3+shp85组胃癌细胞的生长增殖能力较较对照组变化均不明显,该结果表明WASF3促进胃癌细胞的生长和增殖依赖于p85;5、Transwell侵袭实验和细胞划痕实验结果表明,同时调控WASF3和p85的表达后,MGC803+sh WASF3+oep85组和MKN45+oe WASF3+shp85组胃癌细胞的迁移和侵袭能力较对照组变化均不明显,该结果揭示了WASF3促进胃癌细胞迁移和侵袭依赖于p85;6、Western blot结果表明,同时调控WASF3和p85的表达后,PI3K/AKT/NFκB信号通路上相关激酶和效应分子蛋白的表达水平较对照组变化不明显,表明WASF3调控PI3K/AKT/NFκB信号通路依赖于p85;7、免疫共沉淀结果揭示了WASF3与p85之间相互作用的机制可能是WASF3可以影响p110与p85结合。研究结论:WASF3通过影响p110与p85的结合,进而激活PI3K/AKT/NFκB信号通路促进EMT的发生,从而促进胃癌细胞的生长增殖和侵袭迁移。第四部分WASF3通过减少DNA损伤而降低胃癌细胞对奥沙利铂的化疗敏感性及机制研究研究目的:探讨WASF3对胃癌细胞化疗敏感性的影响,并对其作用机制进行初步探讨。研究方法:1、利用慢病毒的质粒感染,构建WASF3稳定低表达和过表达的胃癌细胞;2、应用CCK-8法、平板克隆形成实验,研究WASF3是否影响奥沙利铂对胃癌细胞生长增殖的作用;3、应用细胞划痕实验和Transwell小室侵袭模型实验,研究WASF3是否影响奥沙利铂对胃癌细胞侵袭和迁移能力的作用;4、利用Western blot的方法检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin的表达,对WASF3影响奥沙利铂对胃癌细胞的作用机制进行初步探讨;5、利用彗星实验进一步验证WASF3是否影响奥沙利铂对胃癌细胞的DNA损伤。研究结果:1、CCK8、平板克隆形成实验以及细胞划痕实验、Transwell小室侵袭模型实验结果表明,抑制WASF3的表达后,奥沙利铂对胃癌MGC803细胞的生长增殖、迁移和侵袭的抑制作用进一步增加;使WASF3过表达后,奥沙利铂对胃癌MGC803细胞的生长增殖、迁移和侵袭的抑制作用减弱;2、Western blot结果表明,在抑制WASF3的表达的基础上加入奥沙利铂,胃癌细胞中E-cadherin的表达水平均较单纯加入奥沙利铂时进一步升高,而N-cadherin的表达水平明显进一步下降;相反,在使WASF3过表达的基础上加入奥沙利铂,胃癌细胞中E-cadherin表达的上调程度较单纯加入奥沙利铂组降低,N-cadherin表达的下调程度较单纯加入奥沙利铂组升高;3、彗星实验结果表明,当抑制WASF3的表达后,奥沙利铂引起的胃癌细胞的DAN损伤程度增加,当使WAFSF3过表达后,奥沙利铂导致的胃癌细胞的DNA损伤程度减弱。研究结论:WASF3可能通过增加EMT的发生以及减少DNA损伤,从而降低奥沙利铂对胃癌细胞生长、增殖和侵袭迁移的抑制作用。综合上述实验结果,本研究证实WASF3高表达与胃癌预后差有关,WASF3促进胃癌细胞生长增殖以及侵袭和迁移能力,WASF3能够降低奥沙利铂对胃癌细胞的作用。机制探讨表明,WASF3可能促进p110与p85的结合,进而激活PI3K/AKT/NFκB信号通路促进EMT的发生,从而促进胃癌细胞的生长增殖和侵袭迁移。WASF3还可能通过增加EMT的发生并减少DNA损伤,从而抑制奥沙利铂对胃癌细胞的作用。