【摘 要】
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目的:本研究旨在探明lnc-C18orf26-1/miR-663a/TGF-β3/Smad信号通路在肝星状细胞（HSC）活化中作用及分子机制,并以此阐释黄芪汤（HQT）治疗肝纤维化的作用机理。方法:1.TGF-β1诱导HSC-LX2活化;2.实时定量PCR（RT-qPCR）技术,检测miR-663a、lncRNA及相关基因的表达;3.MTS法检测细胞增殖情况;4.LncRNA芯片检测HSC中lnc
【基金项目】
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No.81773979+黄芪汤干预LncRNA/miR-663a/TGF-β/SMAD信号通路抑制肝星状细胞活化的作用机制研究；
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目的:本研究旨在探明lnc-C18orf26-1/miR-663a/TGF-β3/Smad信号通路在肝星状细胞（HSC）活化中作用及分子机制,并以此阐释黄芪汤（HQT）治疗肝纤维化的作用机理。方法:1.TGF-β1诱导HSC-LX2活化;2.实时定量PCR（RT-qPCR）技术,检测miR-663a、lncRNA及相关基因的表达;3.MTS法检测细胞增殖情况;4.LncRNA芯片检测HSC中lncRNA和mRNA表达情况;5.生物信息学方法预测miR-663a调控的潜在靶基因和相关lncRNA;6.蛋白质印迹法（Western Blot）检测相关基因蛋白表达情况;7.荧光素报告基因实验验证lnc-C18orf26-1与miR-663a间是否存在直接关联;8.网络药理学预测HQT抗肝纤维化的分子机制。结果:1.与正常肝细胞（LO2）比较,HSC中miR-663a呈低表达,TGF-β1诱导HSC活化后miR-663a表达量减少。2.过表达miR-663a能抑制HSC增殖,下调TGF-β1诱导活化的HSC中α-SMA和COLlA2蛋白表达,并能抑制TGF-β1/TGF-βR/Smads信号通路。3.Lnc-C18orf26-1在TGF-β1诱导活化后HSC中表达上调,竞争性结合miR-663a。敲低lnc-C18orf26-1能够有效抑制HSC增殖/活化,下调α-SMA 和 COL1A2 表达,并阻滞 miR-663a 介导的 TGF-β1/Smads。4.HQT 能抑制HSC增殖,且呈浓度依赖性;HQT能促进肝正常细胞增殖,但中低浓度的效果较佳。HQT能促进TGF-β1诱导活化后HSC中TGF-β1对miR-663a的表达且呈浓度依赖性;HQT亦能抑制TGF-β1诱导活化后HSC中lnc-C18orf26-1的表达,低浓度抑制效果最佳。HQT明显抑制活化后HSC中α-SMA、COL1A2、p-Smad2/3及TGF-βRI的表达。miR-663a抑制剂能逆转HQT对TGF-β1诱导HSC活化的抑制作用。5.网络药理学预测分析研究显示:HQT抗肝纤维化的主要作用靶点包括TERT、MET和TNF、TGF-β和MMPs等炎症因子;能影响受体、转录因子、酶和酶调节剂等功能性分子;调控癌症通路、癌症miRNAs、蛋白聚糖和PI3K-Akt等通路;影响激酶活性、NO合成、细胞增殖、细胞迁移、信号转导、DNA复制、磷酸化等生物进程。体现了“HQT抗肝纤维化”药理作用是通过多靶点和多途径的作用特点实现。同时,提示我们肝纤维化可能与TERT基因突变有关,且HQT有利于基因修复。结论:TGF-β1诱导HSC活化后miR-663a低表达,lnc-C18orf26-1高表达,lnc-C18orf26-1作为miR-663a的ceRNA而调控TGF-β1和TGF-βRI的表达而激活HSC。HQT能抑制 lnc-C18orf26-1 而促进 miR-663a 表达,并调控 TGF-β1/TGF-βRI/p-Smad2轴来抑制HSC活化,这或许是其抑制肝纤维化的主要作用机理之一。
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