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目的:本研究以针刺内关穴治疗急性心肌梗死为平台,探讨穴区局部腺苷A1受体介导针刺效应的启动机制。方法:1.实验一针刺内关穴治疗AMI大鼠的效应研究选取健康成年SD大鼠18只,分为假手术组(n=6)、造模组(n=12),造模组大鼠采用结扎LAD(Left Anterior Descending coronary,冠状动脉左前降支)术复制AMI(Acute Myocardial Infarction,急性心肌梗死)模型,成模后大鼠再随机分为模型组和模针组,每组6只。LAD术后即刻应用生理信号记录系统检测大鼠心电图,以ST段弓背抬高0.2mv初步评价造模是否成功。造模后第一天,应用小动物超声仪检测各组大鼠LVEF(Left Ventricular Ejection Fraction,左室射血分数)和LVFS(Left Ventricular Fractional Shortening,短轴缩短率);造模后第二天,对模针组进行双侧内关穴手针治疗,每日1次,连续7天,假手术组和模型组仅予模针组相同的捆绑固定,不予手针治疗。治疗7天后,检测各组大鼠LVEF和LVFS,并用TTC染色法检测心肌梗死面积以评价针刺对AMI的治疗效应。2.实验二针刺内关穴对穴位局部腺苷A1受体和成纤维细胞影响的实验研究在实验一的基础上,进一步取各组大鼠穴区局部组织,应用WB(Western Blotting,免疫印迹)和RT-q PCR(Real-tim Quantitative PCR Detecting System,实时定量基因扩增荧光检测系统)检测穴位局部四个腺苷受体蛋白和基因含量;应用免疫荧光染色法检测穴位局部A1R(Adenosine A1 receptor,腺苷A1受体)阳性表达数量、成纤维细胞数量及成纤维细胞活化蛋白(FAP)数量;应用ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay,酶联免疫吸附测定法)检测穴位局部与成纤维细胞相关细胞因子(IL-6、TNF-α)含量的变化,以评价针刺对穴位局部A1R、成纤维细胞及成纤维细胞相关细胞因子(IL-6、TNF-α)的影响。3.实验三调控腺苷A1受体对针刺治疗AMI大鼠的效应及对成纤维细胞影响的实验研究选取健康成年SD大鼠36只,分为假手术组(n=6)和造模组(n=30),造模组大鼠复制AMI模型,成模后大鼠随机分为模型组、模针组、模针+DMSO组(对照液)、模型+CCPA组(A1R激动剂)、模针+DPCPX组(A1R拮抗剂),每组6只。LAD术后即刻应用生理信号记录系统检测大鼠心电图,以ST段弓背抬高初步评价造模是否成功。造模后第一天应用小动物超声仪检测各组大鼠LVEF和LVFS。造模后第二天,模针组给予针刺双侧内关穴治疗,模针+DMSO组和模针+DPCPX组于针刺前半小时分别在内关穴注射DMSO和DPCPX各20μl,模型+CCPA组每日在内关穴注射CCPA 20μl,模型组不予任何针刺和药物干预。治疗7天后,用小动物超声仪检测各组大鼠LVEF和LVFS,并用TTC染色法检测心肌梗死面积以明确调控穴区局部A1R功能对针刺效应的影响。采用免疫荧光染色法检测穴位局部成纤维细胞数量及活化蛋白(FAP)数量和Elisa检测穴区局部细胞因子(IL-6、TNF-α)含量,以明确调控穴区局部A1R功能对成纤维细胞及相关细胞因子的影响。结果:1.针刺内关穴可改善AMI大鼠心功能,降低心肌梗死面积采用结扎LDH制备AMI模型,通过心电图显示造模后大鼠与造模前相比ST段明显抬高。心脏超声结果显示,与假手术组比较,造模后24h大鼠LVEF和LVFS均显著降低,表明造模成功;在针刺干预7d后,可升高AMI大鼠LVEF和LVFS,降低心肌梗死面积(P<0.01),提示针刺内关穴可改善大鼠心功能,降低心肌梗死面积。2.针刺内关穴使A1R表达增多,成纤维细胞数量增多,IL-6、TNF-α含量升高(1)干预7d后,应用WB和q-PCR检测发现,模针组穴区A1R蛋白含量和基因含量较模型组均有上升趋势,但无统计学差异(P>0.05);应用免疫荧光染色法显示,模针组穴区A1R阳性表达较模型组增多(P<0.01),且穴区A1R主要表达在成纤维细胞上。(2)与模型组相比,模针组穴区成纤维细胞数量和活化蛋白(FAP)表达均增多,有统计学差异(P<0.01)。(3)与模型组相比,模针组穴区细胞因子(IL-6、TNF-α)含量升高,有显著差异(P<0.01)。3.调控穴区局部A1R功能可影响针刺治疗AMI的效应干预7d后,与模型组相比,模针组能改善AMI大鼠心功能活动,提高大鼠LVEF和LVFS,降低心肌梗死面积(P<0.01),提示针刺内关穴改善AMI大鼠心功能有效;与模针组相比,模针+DMSO组、模型+CCPA组的心功能无显著变化(P>0.05),而模针+DPCPX组的心功能降低(P<0.01),表明穴位局部注射对照液DMSO不影响针刺效应,CCPA(A1R激动剂)可模拟针刺效应,DPCPX(A1R拮抗剂)则部分阻断了针刺改善AMI大鼠心功能的效应。4.调控穴区局部A1R功能可影响成纤维细胞及其相关细胞因子含量干预7d后,与模型组相比,模针组、模针+DMSO组、模型+CCPA组能使成纤维细胞数量及活化蛋白(FAP)数量增多(P<0.05),而模针+DPCPX组与模型组之间无显著变化(P>0.05);与模针组相比,模针+DMSO组、模型+CCPA组的成纤维细胞数量及活化蛋白(FAP)数量无显著变化(P>0.05),而模针+DPCPX组的成纤维细胞数量及活化蛋白(FAP)数量减少(P<0.05)。提示针刺内关穴或在穴位局部注射A1R激动剂CCPA能促进穴位局部成纤维细胞数量及活化蛋白数量增多,将A1R阻断后,可部分抑制针刺对成纤维细胞的影响,说明针刺对成纤维细胞的影响是由A1R介导的。同时,与模型组相比,模针组、模针+DMSO组、模型+CCPA组能使穴区IL-6、TNF-α含量升高(P<0.01),模针+DPCPX组无显著变化(P>0.05);与模针组相比,模针+DMSO组、模型+CCPA组的IL-6、TNF-α含量无显著变化(P>0.05),而模针+DPCPX组的IL-6、TNF-α含量减少(P<0.01)。提示针刺内关穴或在穴位局部注射A1R激动剂CCPA能促进穴位局部细胞因子(IL-6、TNF-α)含量的增多,将A1R阻断后,可部分抑制针刺对穴位局部细胞因子的影响。结论:1.针刺内关穴治疗AMI有效,能改善AMI大鼠心功能活动和减少心肌梗死面积。2.针刺通过激活穴区成纤维细胞上的腺苷A1受体,引起成纤维细胞数量和功能发生变化,可能是其介导针刺治疗AMI效应的启动机制之一。