【摘 要】
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目的:以胎牛血清外泌体负载淫羊藿苷,研究外泌体负载后的淫羊藿苷对成骨细胞的增殖作用,为临床有效地应用淫羊藿苷治疗骨破坏相关疾病提供参考依据。方法:提取胎牛血清外泌体,以外泌体负载淫羊藿苷,通过CCK-8、Western Blot和PKH67荧光染色等方法,体外研究外泌体负载后的淫羊藿苷对成骨细胞增殖作用的影响。1、胎牛血清外泌体的提取和鉴定取胎牛血清通过超速离心法提取外泌体。采用透射电子显微镜和纳
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目的:以胎牛血清外泌体负载淫羊藿苷,研究外泌体负载后的淫羊藿苷对成骨细胞的增殖作用,为临床有效地应用淫羊藿苷治疗骨破坏相关疾病提供参考依据。方法:提取胎牛血清外泌体,以外泌体负载淫羊藿苷,通过CCK-8、Western Blot和PKH67荧光染色等方法,体外研究外泌体负载后的淫羊藿苷对成骨细胞增殖作用的影响。1、胎牛血清外泌体的提取和鉴定取胎牛血清通过超速离心法提取外泌体。采用透射电子显微镜和纳米颗粒追踪分析技术,观察分析外泌体的形态、大小及结构。Western Blot检测外泌体表面标记因子CD63、CD81、ALIX及微囊表面标记物CD40的蛋白表达水平。2、胎牛血清外泌体负载淫羊藿苷和鉴定通过共孵育的方法将淫羊藿苷负载至胎牛血清外泌体,采用透射电子显微镜和纳米颗粒追踪分析技术,观察分析外泌体的形态、大小及结构。用高效液相色谱法检测胎牛血清外泌体对淫羊藿苷的负载效率。3、淫羊藿苷和外泌体负载的淫羊藿苷对成骨细胞的增殖作用（1）MC3T3-E1细胞对外泌体和负载淫羊藿苷的外泌体的摄取情况PKH67荧光染色分别标记外泌体和负载淫羊藿苷的外泌体,检测MC3T3-E1细胞对外泌体和负载淫羊藿苷的外泌体的摄取情况。（2）淫羊藿苷对成骨细胞的增殖作用分别使用0、0.1、1、10和20μg/ml淫羊藿苷作用于MC3T3-E1细胞24 h,通过CCK-8法检测各浓度对成骨细胞增殖活性的影响,筛选淫羊藿苷最佳实验浓度。CCK-8检测淫羊藿苷在最佳实验浓度作用0、24和48 h后成骨细胞的增殖活性。Western Blot检测MC3T3-E1细胞在淫羊藿苷的作用下,成骨标记性因子BMP-2、RUNX2和OPN的蛋白表达水平。（3）外泌体负载的淫羊藿苷对成骨细胞的增殖作用CCK-8检测外泌体负载的淫羊藿苷在最佳实验浓度作用0、24和48 h后成骨细胞的增殖活性。Western Blot检测MC3T3-E1细胞在外泌体负载的淫羊藿苷的作用下,成骨标记性因子BMP-2、RUNX2和OPN的蛋白表达水平。结果:1、胎牛血清外泌体提取和鉴定通过透射电子显微镜观察可见具有明显双层膜结构的囊泡,为茶托状,且大小在30-150 nm之间;纳米颗粒追踪分析结果显示,外泌体中值粒径在117 nm左右;Western Blot检测结果显示,外泌体表面标记因子CD63、CD81及ALIX结果为阳性,微囊表面标记物CD40结果呈阴性,胎牛血清外泌体提取成功。2、胎牛血清外泌体负载淫羊藿苷和鉴定通过透射电子显微镜观察可见负载了淫羊藿苷的胎牛血清外泌体同样具备明显的双分子层膜结构,形似茶托状,且颗粒直径略大于单纯的胎牛血清外泌体;纳米颗粒追踪分析结果显示,负载了淫羊藿苷的胎牛血清外泌体的中值粒径在122 nm左右,略大于单纯的外泌体;高效液相色谱法结果显示,胎牛血清外泌体负载淫羊藿苷的效率约13%。3、淫羊藿苷和外泌体负载的淫羊藿苷对成骨细胞的增殖作用（1）PKH67荧光染色结果显示,外泌体和负载淫羊藿苷的胎牛血清外泌体均可被MC3T3-E1细胞正常摄取。（2）MC3T3-E1细胞增殖活性结果1)CCK-8法筛选淫羊藿苷最佳实验浓度实验结果显示当淫羊藿苷浓度为0.1μg/ml时,对MC3T3-E1细胞的增殖活性促进作用最强,因此选择该浓度为最佳实验浓度（P＜0.05）。2)CCK-8法和Western Blot分别检测淫羊藿苷组细胞增殖活性CCK-8结果显示,0.1μg/ml淫羊藿苷作用于MC3T3-E1细胞0、24和48 h后,淫羊藿苷组在各时间点的细胞增殖活性均高于对照组,结果有统计学意义（P＜0.05）。Western Blot结果显示,0.1μg/ml淫羊藿苷作用MC3T3-E1细胞24 h后,淫羊霍苷组的成骨标志性因子BMP-2、RUNX2和OPN的蛋白表达水平均高于对照组,结果均具有统计学意义（P＜0.05）。3)CCK-8法和Western Blot分别检测外泌体负载淫羊藿苷组细胞增殖活性CCK-8结果显示,浓度为0.1μg/ml时作用MC3T3-E1细胞0、24和48 h后,外泌体负载淫羊藿苷组在各时间点的细胞增殖活性均高于淫羊藿苷组,结果有统计学意义（P＜0.05）。Western Blot结果显示,浓度为0.1μg/ml时作用MC3T3-E1细胞24 h后,外泌体负载淫羊藿苷组的成骨标记性因子的蛋白表达水平均高于淫羊霍苷组,结果均具有统计学意义（P＜0.05）。结论:通过共孵育法可成功制备出负载淫羊藿苷的胎牛血清外泌体。胎牛血清外泌体负载的淫羊藿苷比单纯的淫羊藿苷能更有效地促进成骨细胞的增殖。
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