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【背景与目的】动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是心血管疾病最常见的病理过程之一,血管内皮损伤与功能障碍被认为是AS发生的初始环节。细胞凋亡是细胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）的一种,内皮细胞凋亡贯穿AS的整个病理过程。解整合素-金属蛋白酶10（a disintegrin and metalloproteinase 10,ADAM10）是一种跨膜蛋白,能够剪切多种细胞表面分子的胞外域。研究表明,ADAM10通过剪切血管内皮-钙粘蛋白（vascular endothelial cadherin,VE-cadherin）,破坏内皮细胞屏障功能,而四跨膜蛋白亚家族（tetraspanin C8,Tspan C8）作为与ADAM10密切相关的蛋白家族,可能也参与了ADAM10促进内皮细胞损伤的进程。本课题旨在探讨Tspan C8的家族成员是否能通过影响ADAM10的表达水平,促进氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）诱导的内皮细胞凋亡。【方法】（1）配制不同浓度（0、50、100、150、200μg/m L）ox-LDL处理体外培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）,运用显微镜观察及CCK-8实验综合确定ox-LDL的处理浓度;确定ox-LDL浓度并按不同时长（0h、12h、24h、48h）处理HUVECs,运用显微镜观察及CCK-8实验综合确定ox-LDL的处理时间。（2）将HUVECs分为对照组和ox-LDL处理组。采用蛋白免疫印迹实验（Western blot,WB）检测细胞凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、细胞色素C（Cytochrome C,Cyt-C）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Cysteinyl aspartate specific proteinase 9,Caspase-9）的表达水平,并检测ADAM10与VE-cadherin的表达水平。（3）设计并合成si-ADAM10并以无关序列作为对照,分别转染HUVECs,采用WB实验判断转染效率,CCK-8实验判断细胞存活率。转染完成后将空白对照组、si-NC组与si-ADAM10组细胞用100μg/m L ox-LDL处理24小时,并采用WB实验检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Cyt-C与Caspase-9的表达水平以及VE-cadherin的表达水平。（4）为了探讨Tspan C8成员在HUVECs凋亡中可能发挥的作用,将HUVECs分为对照组与ox-LDL组,分别培养后采用WB实验检测Tspan C8各成员（Tspan5、Tspan14、Tspan15、Tspan17）的蛋白水平变化。（5）筛选出表达水平变化最显著的Tspan C8成员Tspan17后,为了验证其作用于ADAM10及其底物VE-cadherin的表达,分别构建干扰质粒sh-Tspan17与过表达载体pc DNA3.1-Tspan17以及阴性对照质粒并通过培养人胚肾细胞（HEK 293T cells,293T）来完成病毒包装和稳转株的建立,转染HUVECs细胞并采用WB实验验证转染效率。（6）将Tspan17敲低组、Tspan17过表达组与空白对照组及阴性对照组分别加入100μg/m L ox-LDL处理24小时,采用WB实验检测ADAM10及VE-cadherin的表达水平。（7）为了进一步观察Tspan17在ox-LDL诱导HUVECs凋亡中对VE-cadherin的调节作用,将空白对照组、阴性对照组及sh-Tspan17组细胞用100μg/m L ox-LDL处理24小时后采用细胞免疫荧光实验检测VE-cadherin的表达水平。（8）为了观察Tspan17在ox-LDL诱导HUVECs凋亡中发挥的作用,将细胞分为空白对照组、阴性对照组及sh-Tspan17组,用100μg/m L ox-LDL处理HUVECs 24小时后,采用细胞免疫荧光实验检测凋亡蛋白Cyt-C的表达水平,WB实验检测凋亡相关蛋白Bcl-2与Caspase-9的水平,CCK-8实验检测细胞存活率,并采用Annexin V-FITC/PI试剂盒分别通过荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞凋亡率。（9）为了验证ADAM10在Tspan17促ox-LDL诱导的HUVECs凋亡中发挥作用,先后转染si-ADAM10及Tspan17过表达载体并按分组加入100μg/m L ox-LDL处理24小时后采用WB实验检测凋亡相关蛋白水平。【结果】（1）综合镜下观察及CCK-8实验结果,确定100μg/m L ox-LDL处理24小时为本实验后续的处理因素。（2）实验结果表明,ox-LDL处理组较对照组中Cyt-C与Caspase-9的蛋白水平升高,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低（P＜0.001）,且ADAM10蛋白水平上升（P＜0.001）,VE-cadherin蛋白水平降低（P＜0.01）。（3）WB实验结果显示,转染si-ADAM10后的ADAM10蛋白水平显著降低（P＜0.01）。CCK-8实验结果显示,转染si-ADAM10后细胞存活率上升（P＜0.01）。随后加入100μg/m L ox-LDL处理24小时,WB实验检测凋亡相关蛋白表达水平的变化。结果显示,转染组较对照组中Cyt-C与Caspase-9的蛋白水平降低（P＜0.05）,而Bcl-2的水平升高（P＜0.01）,同时VE-cadherin蛋白水平升高（P＜0.001）。（4）培养HUVECs并加入100μg/m L ox-LDL处理24小时后,采用WB实验检测Tspan C8家族成员Tspan5、Tspan14、Tspan15、Tspan17蛋白的表达水平,结果发现Tspan17蛋白水平较空白组显著升高（P＜0.01）,而Tspan5、Tspan14、Tspan15的蛋白水平无明显变化。（5）分别构建sh-Tspan17质粒与pc DNA3.1-Tspan17载体并转染内皮细胞建立稳转株,WB实验结果显示转染sh-Tspan17后Tspan17蛋白水平显著降低（P＜0.001）,而转染pc DNA3.1-Tspan17后Tspan17蛋白水平显著升高（P＜0.001）。（6）HUVECs加入100μg/m L ox-LDL处理HUVECs 24小时,WB实验结果显示敲低Tspan17后ADAM10蛋白水平降低且VE-cadherin蛋白水平升高（P＜0.01）;过表达Tspan17后ADAM10蛋白水平升高且VE-cadherin蛋白水平降低（P＜0.01）。（7）100μg/m L ox-LDL处理HUVECs 24小时后进行免疫荧光实验。结果显示,与对照组相比,sh-Tspan17组VE-cadherin的荧光强度明显增强。（8）100μg/m L ox-LDL处理HUVECs 24小时后进行免疫荧光实验,结果表明与对照组相比,sh-Tspan17组凋亡蛋白Cyt-C的荧光强度明显减弱。采用WB实验检测凋亡相关蛋白,结果显示敲低Tspan17后,Caspase-9的蛋白水平降低,同时Bcl-2的蛋白水平升高（P＜0.05）。CCK-8实验结果显示,转染sh-Tspan17后细胞存活率上升（P＜0.01）。使用Annexin V-FITC/PI试剂盒通过荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞凋亡,显示sh-Tspan17组细胞凋亡程度显著低于ox-LDL处理组。（9）先后转染si-ADAM10及Tspan17过表达载体并加入100μg/m L ox-LDL处理HUVECs 24小时,结果显示与对照组相比,在敲低ADAM10的基础上过表达Tspan17,凋亡蛋白Caspase-9与Cyt-C的表达水平降低（P＜0.01）,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平升高（P＜0.05）。【结论】Tspan17通过增强ADAM10活性,下调VE-cadherin表达水平,促进ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡。