传染性海绵状脑病(Transmissible Spongiform Encephalopathis，TSEs)又称朊毒体病(Prion Diseases)是人与动物的一类慢性、致死性、神经退化性疾病。TSEs病原是宿主编码蛋自prpc(Cellular form of Prion Protein)的异构体prpsc(Scrapie-isoform Prion Protein)，现称为朊毒体。Prnp基因编码PrP蛋白，其生物学功能仍不明确。相对于牛、羊等大动物，小鼠是TSEs研究最常用的动物模型，具有易于操作，饲养成本低，发病潜伏期短等优点。在本研究中，笔者克隆、表达了小鼠Prnp基因核心片段及成熟片段，进一步构建了小鼠Prnp基因核心片段P101L突变株，随后对上述小鼠PrP重组蛋白的部分特性进行了研究。 1、小鼠Prnp基因核心片段、成熟片段的亚克隆及表达根据Gene Bank中小鼠Prnp基因序列设计引物，从含有小鼠Prnp基因全长的p MDl8-T载体中，PCR扩增出小鼠Prnp基因的核心片段及成熟片段并进行序列测定，随后将上述基因克隆至原核表达载体pET28a(+)及pET32a(+)，转化入大肠杆菌BL21 (DE3)进行诱导表达，亲和层析纯化表达产物。SDS-PAGE电泳显示：表达产物的-分子量大小与预计相符；免疫印迹试验证实：小鼠Prnp基因核心片段及成熟片段获得了正确表达，并具有良好的抗原性。 2、小鼠Prnp基因核心片段突变株(P101L)的构建及原核表达Prnp基因具有多态性，并存在多种形式的突变，且与致病性相关。小鼠PrP第101位氨基酸由脯氨酸到亮氨酸的突变，可导致小鼠TSEs的发病几率大大增加，与人类的格-斯氏综合症的突变位点极为相似。因此，本研究对该位点进行了突变。采用引物突变引入位点的方法，对“研究 l”构建的核心片段克隆质粒pMDl8-T-cPrP，进行了点突变，经测序分析目的位点突变成功。然后，按常规方法克隆、表达突变基因，SDS-PAGE电泳、Western-blot试验证实：小鼠Prnp基因核心片段突变株(P101L)获得成功表达并具有良好的抗原性。 3、小鼠PrP重组蛋白部分特性的初步研究上述试验共研制出6种重组小鼠PrP蛋白，笔者对其部分生物学特性进行了研究。首先对重组蛋白进行质谱分析，结果表明融合蛋白对表达蛋白的构象和特性具有重要的影响。随后，对包涵体状态以及复性状态的重组蛋白的PK酶抗性进行了测定，结果显示包涵体形式的错误折叠的重组PrP没有获得PK酶抗性。最后，利用4株针对不同表位的抗PrP单抗对各种重组蛋白的ELISA反应性进行了测定，结果显示：PrP 139～168aa为所有重组蛋白展示的优势抗原表位，而PrP109～112aa则没有展示于重组蛋白的表面。 综上所述，本研究利用原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)在大肠杆菌中表达PrP核心片段、成熟片段及突变株，通过变性复性等实验手段，证实在大肠杆菌中表达的朊蛋白是正常朊蛋白prpc，没有PK酶抗性，这和大多数科学家得出的结论相同。同时，这些这些的原核表达系统的构建为进一步研究正常PrP的某些特性打下了基础。