研究背景和意义血管性血友病因子（VWF）在凝血和血栓形成中发挥重要作用,VWF的活化受到严格的调控,目前普遍接受VWF从非活化状态变为活化状态经历了构象的改变,在剪切力达到一定阈值或在其它病理条件下,VWF A1结构域暴露进而与血小板结合。活性VWF增加会使血栓形成的风险增加。血红蛋白是红细胞内的主要成分,其最主要的功能是运输氧气。红细胞破碎时会释放出包括血红蛋白在内的内容物。近年来,临床上发现使用体外循环装置的病人发生溶血时,其血栓形成的风险增加,这无疑加重了病人的病情。游离血红蛋白因此被认为是诱发血栓的因素之一。到目前为止,血红蛋白在VWF介导的血栓中发挥的作用仍不清楚。在本课题中,我们首次发现血红蛋白与活性VVWF A1结构域存在高亲和力结合,并进一步研究了血红蛋白对VWF在体内介导的血栓形成的作用。我们的研究结果表明,血红蛋白选择性地与活性状态的VWF A1结构域结合继而抑制VWF介导的血栓形成。我们的研究一方面填补了血红蛋白与活性VWF A1结构域相互作用研究的空白,另一方面澄清了血红蛋白在VWF介导的血栓形成中的作用。研究目的1.从结构层面,揭示血红蛋白与活性VWF A1结构域及非活性VWF A1结构域结合的差异;2.从功能层面,揭示血红蛋白在VWF介导的血栓中发挥的作用;3.从机制层面,探究血红蛋白发挥抑制血栓作用的途径。研究方法1.血红蛋白与活性/非活性的重组VWF A1结构域结合参数的测定分别纯化血红蛋白和活性/非活性的重组VWF A1结构域片段,利用酶联免疫吸附试验以及微量热泳动试验测定血红蛋白与活性/非活性的重组VWF A1结构域相互作用的热力学参数。2.血红蛋白对活性重组VWF A1结构域功能活性的影响使用纯化的血红蛋白和重组VWF A1结构域片段,利用血小板粘附试验、血小板聚集试验、流式细胞术测定血红蛋白对活性重组VWF A1结构域凝血活性的影响。3.血红蛋白对活化的全长VWF体外凝血活性的影响使用纯化的血红蛋白和全长VWF蛋白,分别使用不同刺激剂诱导全长VWF活化,利用血小板聚集试验、流式细胞术测定血红蛋白对活化的全长VWF在体外的凝血活性的影响。4.血红蛋白对肾小球微血栓形成的影响向小鼠体内注射高/低剂量的血红蛋白,利用免疫荧光染色试验对小鼠肾小球切片并观察其微血栓形成的情况。5.血红蛋白对小鼠血栓模型的影响分别构建三氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓模型、血栓性血小板减少性紫癜模型以及深静脉血栓模型,检测注入游离血红蛋白对小鼠血栓模型的影响。研究结果1.血红蛋白与活性重组VWF A1结构域有较强的结合首先,我们利用分子筛层析成功纯化了纯度较高的人/小鼠血红蛋白及活性/非活性的重组VWF A1结构域片段,酶联免疫吸附试验以及微量热泳动试验结果显示,血红蛋白与活性重组VWF A1结构域结合力较强、与非活性重组VWF A1结构域结合力较弱。2.血红蛋白抑制活性重组VWFA1结构域的活性接着我们利用一系列体外表征实验,研究血红蛋白高亲和力结合活性重组VWF A1结构域,对其活性的影响。血小板粘附试验显示血红蛋白抑制活性重组VWF A1结构域引起的血小板活化的形态改变;血小板聚集试验表明血红蛋白呈浓度梯度依赖性抑制活性重组VWF A1结构域引起的血小板聚集,而其本身的颜色不干扰血小板聚集反应;流式细胞术表明血红蛋白抑制了活性重组VWF Al结构域与血小板的结合及血小板活化信号的传递。3.血红蛋白抑制活化的全长VWF在体外发挥凝血活性针对血红蛋白对全长VWF活性的影响,血小板聚集试验表明血红蛋白抑制全长VWF结合血小板膜糖蛋白Ib（GPIb）的活性,但并不影响collagen、ADP引起的血小板聚集;流式细胞术显示血红蛋白抑制了波特洛毒素诱导的全长VWF与血小板的结合及血小板活化信号的传递。4.血红蛋白本身不引起微血栓先前的文献显示血红蛋白的增多与血栓性疾病有关。在注射血红蛋白监测小鼠血小板数量时,我们发现血红蛋白的增多并未引起小鼠血小板的减少。免疫荧光染色结果表明,血红蛋白本身不会引起微血栓的形成、不会促进VWF介导的血栓的形成。5.血红蛋白缓解了小鼠血栓模型的血栓症状我们分别构建了 VWF介导的不同的血栓模型,研究血红蛋白对VWF在体内介导的血栓的作用。在三氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓模型中,血栓成像结果显示血红蛋白抑制了颈动脉血栓的形成。对于小鼠血栓性血小板减少性紫癜模型,血小板计数结果及血涂片结果均显示血红蛋白缓解了小鼠的血栓症状。在小鼠深静脉血栓模型中,血红蛋白抑制VWF参与的深静脉血栓模型中血栓的形成。结论我们的研究发现1)血红蛋白与活性重组VWF A1结构域有较强的结合;2)血红蛋白抑制活性重组VWF A1结构域的活性;3)血红蛋白抑制活化的全长VWF在体外发挥凝血活性;4)血红蛋白本身不引起微血栓;5)血红蛋白缓解了小鼠血栓模型的血栓症状。