Zn2+几乎是所有病原菌生长必不可少的微量元素,但过量的Zn2+会对细菌产生毒性,因此被宿主免疫细胞作为抑制胞内病原菌生长的策略。结核分枝杆菌和牛分枝杆菌代表了两种最成功的胞内病原菌,具有极强的抗逆生长能力(包括抗Zn2+毒性)。但是,目前关于这些分枝杆菌响应和抵抗Zn2+毒性的分子机制以及信号通路还十分不清楚。本研究鉴于牛分枝杆菌和结核分枝杆菌基因组的高度相似性以及Zn2+毒性在分枝杆菌中的普遍性,以牛分枝杆菌BCG（简称BCG菌株）为研究对象,系统鉴定了一个P1B型ATP酶Ctp G在细菌抗Zn2+毒性和抗宿主免疫过程中的重要作用,主要取得了如下几个方面的实验结果:（1）ctpG的表达显著提高BCG菌株抗Zn2+毒性的能力。通过检测ctpG不同表达水平的重组BCG菌株在Zn2+毒性条件下的生长情况,发现在Zn2+处理条件下敲除ctpG明显减弱了BCG菌株抗Zn2+毒性的能力,而回补野生型基因ctpG则能够恢复敲除菌株对Zn2+毒性的抗性。进一步,分析比较这些重组菌株对Zn2+毒性的耐受能力差异,证实ctpG的表达确实能够显著增强BCG菌株对Zn2+毒性的抗性。这些结果表明,ctpG的表达增强BCG菌株对Zn2+毒性的抗性。（2）Ctp G通过APC序列与Zn2+结合,水解ATP促进Zn2+外排,最终导致BCG菌株在Zn2+毒性条件下的存活能力增强。系统发育树以及氨基酸序列比对分析表明,Ctp G与Zn2+转运蛋白的序列相似性较高,具有多个保守的结构域,但Zn2+结合位点稍有不同。其中,Ctp G含有一个独特的结合Zn2+的APC位点。通过氨基酸定点突变结合酶促动力学实验证实:野生型蛋白Ctp G与其突变体蛋白Ctp G（Mut）和Ctp G（?APC）在正常条件下的ATP酶活性没有明显差异;在Zn2+存在条件下,Zn2+促进野生型蛋白Ctp G的ATP水解活性,但不影响两个突变体蛋白的ATP水解活性,而且其它金属离子不影响这些蛋白的ATP酶活性。进一步,Ctp G能够促进BCG菌株在Zn2+毒性条件下胞内过量Zn2+的外排,而且外排Zn2+的效果明显好于Zn2+外排蛋白Ctp C;然而,在相同条件下,突变体蛋白Ctp G（Mut）和Ctp G（?APC）则失去了外排Zn2+的能力。随后,通过分析比较这些重组菌株在Zn2+毒性条件下的存活差异,发现ctpG敲除菌株和两个突变体基因的互补菌株在Zn2+毒性条件下的存活能力明显降低。综合上述实验结果,Ctp G是一个新颖的Zn2+外排蛋白,通过APC序列结合Zn2+促进蛋白的ATP水解活性,将Zn2+排出胞外,增强BCG菌株抗Zn2+毒性的能力。（3）Zn2+诱导ctpG的表达且该过程依赖于转录因子Cmt R。通过分析BCG菌株在Zn2+毒性条件下胞内ctpG的表达情况,发现ctpG的表达量随着Zn2+浓度的增加而逐渐增加。而且,Zn2+诱导ctpG表达的倍数（约50倍）明显高于Zn2+外排蛋白基因ctp C的表达倍数（约10倍）。然而,在相同条件下,其它金属离子(除Cd2+外)则不影响BCG菌株胞内ctpG的表达。随后,RT-q PCR实验证实Zn2+能够解除转录因子Cmt R对ctpG的抑制作用。进一步,通过分析Zn2+诱导ctpG表达对Cmt R的依赖性,发现野生型BCG菌株胞内ctpG的表达水平显著受到Zn2+的诱导,而cmt R敲除型菌株在相同条件下胞内ctpG的表达水平则没有明显变化。这些结果表明,Zn2+诱导BCG胞内ctpG的表达且该过程依赖于转录因子Cmt R。（4）Ctp G有利于BCG菌株抑制巨噬细胞THP-1胞内Zn2+毒性,增强细菌的胞内存活能力。通过分析比较野生型和ctpG敲除型BCG菌株感染的THP-1胞内游离Zn2+含量以及细菌与Zn2+的共定位,发现ctpG敲除菌株感染的巨噬细胞内游离Zn2+含量显著增加,而且细菌与Zn2+的共定位更明显。进一步,RT-q PCR实验证实:敲除ctpG和互补突变体基因ctpG（Mut）和ctpG（?APC）的BCG菌株在感染的过程中刺激了巨噬细胞内Zn2+毒性相关蛋白基因mtf1,mt1和mt2的表达。最后,通过分析比较ctpG重组BCG菌株在THP-1胞内的存活能力,发现ctpG敲除菌株和两个互补突变体菌株的存活能力明显低于野生型菌株,而ctpG超表达菌株的存活能力则显著高于野生型菌株。因此,这些实验结果表明,Ctp G能够抑制巨噬细胞内Zn2+毒性并增强细菌的胞内存活能力。（5）ctpG的表达导致BCG菌株在感染小鼠体内的毒力增强。利用小鼠模型分析比较ctpG重组菌株的存活能力,发现敲除ctpG显著降低了BCG菌株在小鼠体内的存活,而超表达ctpG则明显增强了BCG菌株的存活能力。进一步,病理切片和RT-q PCR实验结果证实,ctpG超表达菌株的高存活能力导致小鼠肺部更多炎症细胞浸润和脾脏炎症因子的产生,而敲除菌株则与之相反。综合上述实验结果,Ctp G有助于增强BCG菌株的毒性。综上所述,本研究首次发现牛分枝杆菌P1B型ATP酶Ctp G是一个新的Zn2+外排蛋白,能够显著增强细菌抗Zn2+毒性的能力,并系统阐明了其应答和抵抗Zn2+毒性的分子机制以及信号通路(Zn2+-Cmt R-Ctp G),同时也明确了Ctp G增强细菌在巨噬细胞和小鼠体内存活的潜在机制。这些工作拓展了我们对分枝杆菌适应环境压力和抗Zn2+毒性机制的认识,并有望为结核病的防治提供潜在的药物靶点。