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神经胶质瘤作为最常见的颅内恶性肿瘤之一,具有浸润性生长、病死率高、易复发等特点,多年来一直是神经外科领域研究的热点和难点。除传统治疗方法外,确定胶质瘤发生发展中的相关基因至关重要;以此作为治疗靶点,将有助于为胶质瘤的治疗方案制定提供更有效的选择,这就需要不断深入探索胶质瘤的分子机制。钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶1D(Calcium/Calmodulin Dependent Protein Kinase ID,CAMK1D)广泛表达于人体组织,参与多种肿瘤的发生发展。然而,它在胶质瘤中发挥的功能目前尚未明确。本研究旨在探讨并进一步研究调控CAMK1D基因的表达对脑胶质瘤U251和U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其相关机制,为研究胶质瘤的分子机制和探索新的治疗靶点提供一定的理论依据。第一部分FBXL7与胶质瘤级别及预后的关系及其对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响研究目的:探讨FBXL7在不同级别胶质瘤中的表达水平及其在胶质瘤细胞株中的表达水平及其与胶质瘤分级和预后的关系。探讨FBXL7对U87和U251胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:采用实时荧光定量PCR的方法检测正常脑组织和不同级别(IIV级)胶质瘤组织标本中FBXL7的mRNA表达水平,同时检测正常胶质细胞和五种胶质瘤细胞株(H4、A172、LN229、U87、U251)中的FBXL7的mRNA表达水平;采用Western Blotting的方法监测正常胶质细胞和上述五种胶质瘤细胞株中FBXL7的蛋白表达水平;采用K-M生存分析及Log-rank Test研究FBXL7的表达与胶质瘤患者生存时间之间的关系。构建sh con慢病毒、sh FBXL7慢病毒质粒,分别转染U87和U251胶质瘤细胞株,转染后采用荧光定量PCR和Western Blotting的方法检测转染前后FBXL7在U87和U251胶质瘤细胞中的表达水平;采用细胞迁移及侵袭实验检测转染前后U87和U251细胞的迁移和侵袭能力的变化;采用CCK8比色法检测转染前后U87和U251细胞增殖能力的变化;采用Western Blotting的方法测定转染前后U87和U251细胞中Ki-67蛋白表达水平。结果:随着胶质瘤级别的增高,FBXL7的mRNA表达水平亦升高,FBXL7在五种不同胶质瘤细胞株(H4、A172、LN229、U87、U251)中mRNA及蛋白表达水平均高于正常胶质细胞;K-M生存分析及Log-rank Test结果示FBXL7高表达者的生存率低于低表达者。成功构建了sh con慢病毒对照及sh FBXL7慢病毒质粒并成功进行了细胞转染,转染sh FBXL7慢病毒质粒的U87和U251细胞,FBXL7在mRNA水平及蛋白水平的表达均明显降低,与转染sh con慢病毒质粒的对照组相比,有明显统计学差异。Transwell细胞迁移和侵袭实验结果示转染sh FBXL7慢病毒质粒的U87和U251胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力均明显低于转染sh con慢病毒对照组细胞。CCK-8实验结果示转染sh FBXL7慢病毒质粒的U87和U251胶质瘤细胞增殖能力及细胞活性均明显低于转染sh con慢病毒对照组细胞。Western Blotting实验结果示转染sh FBXL7慢病毒质粒的U87和U251胶质瘤细胞的Ki-67表达水平明显低于转染sh con慢病毒对照组细胞。统计学分析示二者之间的差异均有统计学意义。结论:1.FBXL7在胶质瘤发生发展中可能发挥促进作用,其表达水平与胶质瘤的恶性度呈正相关,并与胶质瘤患者的生存期相关,可作为判断胶质瘤预后的一个指标。2.U87和U251细胞转染sh FBXL7慢病毒质粒后FBXL7的表达被敲低,细胞的迁移、侵袭及增殖力均下降。FBXL7与胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力呈正相关、与胶质瘤细胞的增殖能力呈正相关。第二部分miR-152-5p在胶质瘤中的表达与作用及其对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响研究目的:通过生物信息学网站预测分析miR-152-5p与FBXL7之间是否存在调控关系,同时探讨miR-152-5p在不同级别胶质瘤及胶质瘤细胞株中的表达水平及其与胶质瘤分级和预后的关系。探讨miR-152-5p对U87和U251胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法:采用荧光素酶双基因报告分析的方法确定miR-152-5p与FBXL7之间是否存在碱基互补序列;采用实时荧光定量PCR的方法监测正常脑组织及不同级别胶质瘤组织标本中miR-152-5p的表达水平及正常脑胶质细胞和胶质瘤细胞株(H4、A172、LN229、U87、U251)中的miR-152-5p的表达水平;将U87和U251胶质瘤细胞各分为四组,分别转染miR-con、miR-152-5p mimic、anti-miR-con、anti-miR-152-5p mimic后,采用Western blotting方法检测U87和U251胶质瘤细胞中FBXL7蛋白的表达水平;采用Real-time PCR法检测IV级胶质瘤组织中FBXL7 mRNA和miR-152-5p的表达水平,并通过Spearman相关分析确定二者之间的关系。将miR-152-5p mimic和miR-con空白对照分别转染U87和U251胶质瘤细胞,转染后采用实时荧光定量PCR的方法检测miR-152-5p的表达水平;采用Transwell细胞迁移及侵袭实验检测转染miR-152-5p mimic和miRcon的U87和U251细胞的侵袭和迁移能力;采用CCK8比色法检测转染miR-152-5p mimic和miR-con后U87和U251细胞的增殖能力;采用Western Blotting监测转染miR-152-5p mimic和miR-con后U87和U251细胞中Ki-67蛋白表达水平。结果:通过荧光素酶双基因报告分析证实miR-152-5p和FBXL7 WT的3’-UTR之间存在互补位点;正常脑组织中miR-152-5p表达水平最高,随着胶质瘤级别的增高,miR-152-5p的表达水平逐渐降低;在NHAS中miR-152-5p表达水平明显高于各个胶质瘤细胞系,差异均有统计学意义;转染miR-152-5p mimic的U87和U251胶质瘤细胞中,FBXL7蛋白表达降低,同对照组相比有统计学意义,转染anti-miR-152-5p mimic的U87和U251胶质瘤细胞中,FBXL7蛋白表达明显增高,同对照组相比有统计学意义;Spearman相关分析结果示在IV级胶质瘤中FBXL mRNA表达水平与miR-152-5p表达水平呈负相关。成功转染miR-152-5p mimic和miRcon至U87和U251胶质瘤细胞并获得稳定转染的细胞系;转染miR-152-5p mimic的U87和U251细胞中miR-152-5p的表达水平明显高于转染miR-con空白对照质粒的U87和U251细胞,差异有统计学意义;Transwell细胞迁移和侵袭实验结果示转染miR-152-5p mimic的U87和U251胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力均明显低于转染miR-con空白对照质粒的U87和U251胶质瘤细胞,差异有统计学意义;CCK-8实验结果示转染miR-152-5p mimic的U87和U251胶质瘤细胞的增殖能力及细胞活性均明显低于转染miR-con空白对照的U87和U251胶质瘤细胞,差异有统计学意义;Western Blotting实验结果示转染miR-152-5p mimic的U87和U251胶质瘤细胞的Ki-67表达水平明显低于转染miR-con空白对照的U87和U251胶质瘤细胞,差异有统计学意义。结论:1.MiR-152-5p在胶质瘤中的表达与FBXL7的表达呈负相关,FBXL7是miR-152-5p调控的靶基因之一。MiR-152-5p通过与FBXL7 WT的3’-UTR之间的互补位点相结合下调FBXL7的表达。2.MiR-152-5p可以抑制胶质瘤细胞的侵袭、迁移和增殖,在胶质瘤的发生发展过程中发挥负调节的作用,即抑癌基因的作用。第三部分miR-152-5p通过靶向FBXL7抑制胶质瘤细胞生长并增强胶质瘤对替莫唑胺治疗的敏感性目的:探讨miR-152-5p与FBXL7之间的靶向调控对胶质瘤细胞迁移、侵袭及增殖的作用及其对于TMZ诱导的细胞毒作用的影响。方法:分别将miR-con、miR-152-5p mimic、miR-152-5p mimic+pc DNA3.1 empty vector、miR-152-5p mimic+pc DNA-FBXL7分别转染U87和U251细胞,转染成功后将两种胶质瘤细胞分别分为miR-con、miR-152-5p、miR-152-5p+empty vector、miR-152-5p+FBXL7四组;采用Real-time PCR和Western Blotting的方法检测并比较各组细胞FBXL7mRNA和蛋白水平的表达;采用Transwell细胞迁移和侵袭实验检测并比较各组细胞的迁移和侵袭能力;采用CCK-8比色法检测并比较各组细胞的生存能力;采用Western Blotting的方法检测并比较各组细胞Ki-67的蛋白表达水平;采用CCK-8比色法检测并比较经TMZ(100μM)处理48小时后各组细胞的存活率。结果:miR-152-5p组FBXL7 mRNA和蛋白水平表达均明显低于miRcon组,miR-152-5p+FBXL7组FBXL7 mRNA和蛋白水平表达均明显高于miR-152-5p+vector组,差异有统计学意义;miR-152-5p组细胞迁移和侵袭数量明显低于miR-con组,miR-152-5p+FBXL7组细胞迁移和侵袭数量明显高于miR-152-5p+vector组,差异有统计学意义;miR-152-5p组细胞生存能力明显低于miR-con组,miR-152-5p+FBXL7组细胞生存能力明显高于miR-152-5p+vector组,差异有统计学意义;miR-152-5p组Ki-67蛋白表达水平明显低于miR-con组,miR-152-5p+FBXL7组Ki-67蛋白表达水平明显高于miR-152-5p+vector组,差异有统计学意义。联合TMZ处理实验结果示:TMZ+miR-con组细胞存活率明显低于Untreated组,TMZ+miR-152-5p组细胞存活率明显低于TMZ+miR-con组,TMZ+Vector组细胞存活率明显低于TMZ+FBXL7组,TMZ+miR-152-5p+Vector组细胞存活率明显低于TMZ+miR-152-5p+FBXL7组,差异均有统计学意义。结论:MiR-152-5p通过靶向下调FBXL7的表达,抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭和增殖,同时能够增强TMZ诱导的细胞毒作用。