多形核中性粒细胞（PMNs）是最早被招募到炎症部位的免疫细胞,构成免疫系统抵御病原微生物入侵的首道防线。PMNs发挥免疫保护作用的主要机制之一是分泌中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）,包括中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、组织蛋白酶G（Cat G）和蛋白酶3（PR3）。作为多功能蛋白酶,NSPs在炎症性疾病中发挥重要作用:PMNs的异常积累和激活导致活性NSPs的过度分泌,进而对组织器官造成损伤。NSPs参与多种炎症性疾病的进程,例如败血症、急性胰腺炎、类风湿性关节炎、呼吸系统的炎症性疾病,包括慢性阻塞性肺疾病（COPD）、非囊性纤维化支气管扩张（NCFBE）和新型冠状病毒肺炎（COVID-19）。因此,NSPs被认为是治疗PMN相关炎症性疾病的生物学靶标。开发直接靶向NSPs的药物是调控NSPs活性水平最直接的方式,但是在实际药物开发过程中困难重重。这促使研究人员去寻找一种间接手段来抑制NSPs活化。组织蛋白酶C（Cathepsin C,CatC）是一种重要的溶酶体半胱氨酸蛋白酶,它介导NSPs的成熟过程,并参与PMN相关的炎症和免疫调节过程。因此,CatC是治疗PMN相关炎症性疾病和自身免疫性疾病有吸引力的靶点,以CatC为治疗靶点的药物开发具有广阔前景。CatC抑制剂的开发已经有二十多年历史,几乎所有报道的CatC抑制剂都是含有亲电“弹头”结构的肽基衍生物,可以与CatC生物活性催化位点处的Cys234形成共价键来发挥作用,但是尚没有任何CatC抑制剂成功上市。究其原因主要是:高反应性亲电“弹头”结构和肽基结构带来的代谢不稳定性和潜在的脱靶毒性。在新型CatC抑制剂开发中,为了避免肽基共价衍生物的缺陷,探讨具有新型作用机制的CatC抑制剂开发,我们提出了“非肽基-非共价CatC抑制剂”的可能性。我们希望新型非肽基-非共价CatC抑制剂在避免由亲电“弹头”和肽基结构带来的代谢稳定性差和安全隐患同时,能有效抑制体内外CatC活性和下游NSPs活化,并能在体内表现出有效的抗炎活性,可以用于PMN相关炎症性疾病的治疗。本研究描述了第一个新型强效非肽基-非共价CatC抑制剂的完整发现过程,包括命中化合物的发现、药物化学优化、基于结构的药物设计、急性毒性研究、药物代谢动力学（PK）研究、体内靶标及下游生物学指标活性检测和体内抗炎活性评价。通过体外酶活测定筛选实验室内部分子库,我们发现了化合物14是一个有效的非肽基-非共价CatC抑制剂,显示出中等的CatC活性抑制作用,IC50值为985 n M。以命中化合物14为起点,经过药物化学优化、基于结构的药物设计和构效关系（SAR）研究,我们获得了先导化合物54,其对CatC表现出很强的抑制作用,IC50值为57 n M。对接研究指出,化合物54与CatC的结合方式与既往报道的任何共价CatC抑制剂的结合方式均不同,这可能是由于没有亲电“弹头”结构的存在。该化合物嵌入S1位点和S2口袋中,并通过多种类型相互作用维持与靶标活性位点的结合。为了验证非肽基-非共价CatC抑制剂的半胱氨酸组织蛋白酶家族选择性,我们测试了化合物54对多种半胱氨酸组织蛋白酶的抑制作用,符合预期目标,化合物54显示出极高的家族内选择性。细胞热位移分析研究指出化合物54以浓度依赖性的方式提高CatC对温度的耐受性,表明化合物54能够很好的和靶标结合。对CatC的长期药理抑制能够导致活性NSPs的消除。为了评估化合物对下游活性NSPs的影响,我们检测了化合物54对CatC和NSPs的抑制作用,化合物54以剂量依赖性的方式抑制HL-60细胞中CatC和NSPs的活性水平。我们再次用蛋白质印迹实验评估了用化合物54处理后的C57BL/6小鼠骨髓细胞中NSPs的稳定性,结果表明化合物54处理骨髓细胞48小时后,细胞中NE、Cat G和PR3分别降解到原始水平的47.8%,27.8%和19.9%。这些结果表明化合物54能够抑制细胞中CatC的活性和NSPs的活化。进一步的理化性质研究和体内外PK研究考察化合物的成药性质。结果显示化合物54表现出较好的理化性质,在水、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、人工胃液和人工肠液中的溶解度分别为0.035,0.034,6.500和0.016 mg/m L;脂水分配系数（Log P）为1.87,遵循类药五原则。在Caco-2渗透率实验中,该化合物表现出中等渗透率,无明显外排现象,表观渗透系数(Papp)值为1.6×10-6cm/s。化合物54对人和小鼠的肝微粒体均表现出可接受的稳定性,此外,该化合物对细胞色素P450酶（CYP）亚型2C9,2D6和3A4的作用不显著,IC50值大于25μM,对1A2和2C19的抑制作用较弱,IC50值分别为13.0和7.1μM。体内PK研究表明,口服给药下化合物54的生物利用度约为16.7%。最后分别考察了化合物54在正常小鼠和COPD大鼠模型中的药物效应学（PD）。化合物54对体内CatC活性和下游NSP活化水平的抑制作用通过每天两次向小鼠口服给药（5,15,45 mg/kg）连续6天来评估。在正常小鼠骨髓和血液中均观察到CatC活性和下游NSPs活化明显剂量依赖性降低。在最高剂量组中,骨髓中CatC和NSPs（NE,Cat G,PR3）的活性被抑制至正常组水平的16.2%,28.3%,17.2%和30.8%。在香烟烟雾和脂多糖（LPS）刺激诱导的大鼠COPD模型中,化合物54显示出很好的炎症治疗作用。在大鼠的骨髓、血液、肺和支气管肺泡灌洗液（BALF）中均观察到CatC活性和NSPs活化明显剂量依赖性降低。肺部组织病理切片显示模型组可见肺泡出血扩张、部分肺泡融合、炎性细胞浸润、肺泡结构破坏等显著炎性改变,而化合物54可以明显改善这些组织病理学变化。此外,各组织中干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等促炎细胞因子的水平都表现出不同程度的降低。总之,化合物54在COPD动物模型中表现出优秀的抗炎活性。本项研究初步完成了非肽基-非共价CatC抑制剂完整而系统的发现和评价工作,实验结果一定程度上验证了我们在提出非肽基-非共价CatC抑制剂时的最初设想。这些结果鼓励我们继续开发更有效的非肽基-非共价CatC抑制剂,开展更深入的机制研究,拓展非肽基-非共价CatC抑制剂的适应症。