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壬基酚(Nonylphenol,NP)是典型的环境神经毒物,具有用途广、污染严重及毒作用大等特点。目前,NP所致的神经毒性机制不明,研究报道NP暴露可激活小胶质细胞膜上Toll样受体4(Toll-like Receptor 4,TLR4),引发神经炎症反应。由核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体所介导的焦亡(Pyroptosis)是近年新发现的一种伴炎性反应的细胞程序性死亡方式,是多种神经/精神疾病机制研究的热点。TLR4是NLRP3炎症小体介导的焦亡发生的第一启动信号,NP所致的炎症反应是否诱发神经焦亡的发生,目前未见报道。脑中micro RNAs(miRNAs)含量丰富,在神经发育中受到严格控制,精确定位于易感群体或生命早期阶段,常作为疾病发展初期的生物标志物。而miRNAs在NP神经毒性中发挥着怎样的调节作用,目前未见报道。前期发现,NP(80 mg/kg/d)染毒SD大鼠90天后,经全转录组测序显示NP暴露可使脑中miR-542-3p下调;结合生物信息学分析及文献报道:miR-542-3p可靶向调控TLR4。中脑黑质区(substantia nigra)小胶质细胞数量多是其特定的定位结构之一,且易受环境毒物的影响。体内实验,NP(80mg/kg/d)染毒SD大鼠90天后发现:黒质区小胶质细胞被激活,miR-542-3p表达下调,而TLR4与焦亡相关指标的基因/蛋白表达增加,从而判断NP暴露诱发了该脑区焦亡的发生。小胶质细胞是脑内先天免疫细胞,神经炎症反应的核心细胞。于是,我们猜测miR-542-3p是否可通过调节TLR4参与NP致小胶质细胞焦亡的发生呢?体外实验先验证,NP暴露于BV2小胶质细胞后,miR-542-3p、TLR4与焦亡相关指标的改变与体内一致。然后,通过抑制与过表达BV2细胞中miR-542-3p,明确其对TLR4的调控作用;最后检测过表达miR-542-3p后TLR4与焦亡相关指标的改变。综上,通过上述研究判断NP是否通过miR-542-3p/TLR4/NLRP3调控网络导致小胶质细胞焦亡的发生,探索针对NP神经毒性的调控靶点。第一部分:壬基酚暴露致大鼠运动能力下降和神经细胞焦亡及对miR-542-3p/TLR4的影响目的:探索壬基酚(Nonylphenol,NP)灌胃染毒后,大鼠运动能力、中脑黒质区神经细胞焦亡以及对miR-542-3p/TLR4的影响。方法:将36只36日龄SD大鼠分为:空白组(玉米油,Control),NP组(80mg/kg·bw/day,NP),阳性组(脂多糖,LPS),每组12只。(1)NP持续染毒90天后,高效液相色谱法检测中脑组织NP含量。(2)Y迷宫、矿场、疲劳转棒实验判断NP暴露后大鼠空间学习/记忆与运动能力的改变。(3)全转录组测序后,通过差异倍数(|log2(Fold change)|>1)和显著水平(p-value<0.05)挑选出样品间的差异表达miRNAs,并通过Targetscan及miRDB数据库寻找差异表达基因的靶基因。(4)HE、荧光、透射电镜观察NP暴露后大鼠黒质区病理组织及超微结构的改变。(5)RT-PCR检测黒质区miR-542-3p、TLR4与焦亡指标(NLRP3、GSDMD、caspase-1、IL-1β)基因水平。(6)蛋白质印迹法检测TLR4、NLRP3、pro-caspase-1/caspase-1、GSDMD-N与ASC oligomer/monomer的蛋白表达;(7)ELISA检测IL-1β的含量。结果:(1)NP暴露组中脑组织中NP含量明显高于空白与LPS组(P<0.05)。(2)与空白组相比,NP组大鼠进入Y迷宫新臂与矿场中央的频数降低(P<0.05);转棒实验中,对照组、NP组与LPS组大鼠在转棒上的持续时间依次减少(P<0.05)。(3)NP暴露大鼠脑组织miRNAs全转录组测序发现:与空白组相比,14个miRNAs表达有差异(P<0.05),其中miR-542-3p下调;生物信息学分析显示miR-542-3p与TLR4 m RNA序列存在结合位点,并结合文献显示TLR4是miR-542-3p的靶基因。(4)NP与LPS组黒质区神经细胞排列紊乱,形态异常,细胞肿胀,质膜破裂、淡染,核固缩/坏死。(5)NP与LPS组黒质区小胶质细胞被激活,表现为胞体增大,突起变粗变少甚至回缩呈“阿米巴”样。(6)NP与LPS组小胶质细胞包膜破坏,胞质肿胀;细胞核不规则,异染色质减少、边聚于核膜,核膜界限断裂且伴空泡化;损伤线粒体数量增多。(7)与对照组相比,NP与LPS组黒质区miR-542-3p表达依次减少,而TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD与IL-1βm RNA表达增加(P<0.05)。(8)与对照组相比,NP与LPS组黒质区TLR4、NLRP3、pro-caspase-1/caspase-1、GSDMD-N与ASC oligomer/monomer蛋白表达量增加(P<0.05)。(9)IL-1β的浓度在对照、NP与LPS组中依次增加(P<0.05)。结论:NP暴露致大鼠空间学习记忆力及全身运动能力下降,中脑黒质区小胶质细胞激活伴焦亡发生,miR-542-3p下调。第二部分MiR-542-3p调节TLR4参与壬基酚致小胶质细胞焦亡的机制研究目的:明确NP暴露诱发小胶质细胞焦亡的发生、miR-542-3p对TLR4的调节作用以及NP是否通过miR-542-3p/TLR4/NLRP3调控网络致焦亡的发生。方法:(1)体外第一部分分组:空白(Control)组,阳性对照(LPS)组与NP组;第二部分分组:mimics NC组、miR-542-3p mimics组、mimics NC+NP组与miR-542-3p mimics+NP组。(2)CCK8判断BV2小胶质细胞NP染毒浓度。(3)免疫荧光检测BV2细胞中ASC蛋白表达。(4)RT-PCR检测miR-542-3p、TLR4、NLRP3、GSDMD、caspase-1与IL-1β的基因表达。(5)蛋白质印迹法检测TLR4、NLRP3、GSDMD-N、caspase-1及IL-1β的蛋白表达。结果:细胞第一部分:(1)BV2小胶质细胞NP染毒浓度为40μM。(2)与对照组相比,NP与LPS组ASC荧光强度增加且可见ASC speck斑点(P<0.05)。(3)与对照组相比,miR-542-3p在NP组与LPS组中下调,而TLR4、caspase-1与IL-1β基因水平在NP组与LPS组中增加(P<0.05)。(4)与LPS组一致,NP暴露可使BV2细胞中TLR4、NLRP3、GSDMD-N、caspase-1与IL-1β蛋白表达增加(P<0.05)。以上结果明确了NP暴露诱发了BV2细胞发生焦亡。细胞第二部分:(1)转染miR-542-3p模拟物可明显增加BV2细胞中miR-542-3p的表达,转染miR-542-3p抑制物可下调miR-542-3p的表达(P<0.05)。(2)转染miR-542-3p模拟物可抑制TLR4 m RNA的表达,而转染miR-542-3p抑制物却增加了TLR4 m RNA的表达。(3)相对于mimics NC组,mimics NC+NP组BV2细胞ASC荧光强度增加;相对于mimics NC+NP组,miR-542-3p mimics+NP组ASC荧光强度明显降低(P<0.05)。(4)NP暴露可使miR-542-3p的表达量减少,miR-542-3p过表达可抑制NP暴露引起的miR-542-3p的下调(P<0.05)。与mimics NC相比,过表达miR-542-3p可使TLR4、NLRP3与caspase-1 m RNA表达量减少(P<0.05);相对于mimics NC+NP,过表达miR-542-3p则能抑制NP暴露导致的TLR4、NLRP3与IL-1βm RNA表达量增加(P<0.05)。(5)与mimics NC组相比,NP暴露则可使TLR4、NLRP3、caspase-1及IL-1β蛋白增加(P<0.05);与mimics NC+NP组相比,转染miR-542-3p则能显著抑制NP暴露所引起的TLR4、NLRP3、caspase-1及IL-1β蛋白增加。以上结果表明过表达miR-542-3p可通过抑制TLR4减轻NP诱导的BV2小胶质细胞焦亡的发生。结论:NP通过下调miR-542-3p减弱对TLR4的调节作用诱发了小胶质细胞焦亡的发生。