猪传染性胃肠炎(Porcine transmissible gastroenteritis，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的一种以一周龄以下仔猪呕吐、水样腹泻和高死亡率(通常为100％)为主要特征的传染病。该病是一种世界性的疾病，给畜牧业生产带来巨大的经济损失。由丁它主要引起一周龄以下仔猪几乎100％死亡，所以及早的确诊对该病的防治就具有特别重要的意义，因此建立一种快速、高灵敏度的诊断方法对防治TGE是十分必要的。而传统的检测方法都不能满足特定要求，荧光定量PCR技术的出现解决了这一难题。本研究根据猪传染性胃肠炎病毒N基因和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针，RT-PCR扩增得到目的基因，并克隆到pMD18-T载体得到阳性质粒，用分光光度计对质粒定量，10倍梯度稀释即为质粒标准品。通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化，建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法。同时对60份现地病料进行检测并与常规RT-PCR方法、TGEV抗原快速检测试剂盒(免疫层析法)比较。结果，该方法的检测敏感性达到15拷贝／μl，且具有很好的特异性和重复性，而常规RT-PCR方法只能检测到1.53×10~3拷贝／μl。对现地病料的检测结果也表明该法比常规RT-PCR方法和TGEV抗原快速检测试剂盒的敏感性高。猪呼吸道冠状病毒(Porcine respiratory coronavirus，PRCV)是TGEV的基因缺失变异株，PRCV和TGEV核苷酸序列比较同源性达96％。由于TGEV和PRCV基因组结构十分相似，抗原有相关性，产生的中和抗体有交叉反应，因此多克隆抗体等血清学方法很难将二者区分开。PRCV与TGEV相比，其S基因N末端有大量碱基缺失，不同的PRCV毒株其碱基缺失情况也各不相同，有621～681个碱基不等的缺失，并导致PRCV失去两个抗原位点。本研究根据已发表的PRCV基因组序列(GenBank登陆号：DQ811787)中的S基因序列和本实验室测定的TGEV华毒弱毒株的S基因序列进行比对分析，用一对特异性引物对PRCV S基因缺失区域即TGEV S蛋白的B和C抗原位点(91～513nt)进行扩增，扩增后的片段克隆到pET30a(+)表达载体进行原核表达。SDS-PAGE结果表明，目的蛋白成功表达，且蛋白表达量很高，占菌体总蛋白的45.4％。Western blot分析结果表明目的蛋白具有很好的免疫学活性。本研究成功的高效表达了TGEV S蛋白B、C抗原位点多肽，为TGEV和PRCV的血清学鉴别诊断，或用于制备特异性单克隆抗体以区分TGEV和PRCV等奠定了重要的基础。