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本研究的目的是克隆马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白(CP)基因并构建其原核表达载体，使其在大肠杆菌中高效表达，用表达的融合蛋白作为抗原制备抗血清，为进一步制备PLRV的ELISA检测试剂盒打基础。从感染PLRV的马铃薯病叶中提取总RNA并作模板，通过RT-PCR扩增获得了PLRV-CP基因的特异性扩增带。回收约630bp的特异扩增片段，然后进行T-A克隆。经PCR检测及BamHⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ限制性酶切鉴定，筛选出了阳性克隆，其重组质粒被命名为pGEM-LRCP。序列测定结果表明pGEM-LRCP中的插入片段就是PLRV-CP基因，长627bp，编码208个氨基酸。该基因与国内外已报道的36个PLRV-CP基因相比，核苷酸序列的同源性高于96％，氨基酸序列的同源性均在97％以上。以pGEM-LRCP为模板进行PCR，获得了PLRV-CP基因的扩增产物(无终止密码)，回收624bp的特异产物并与T表达载体pBAD／Thio-TOPO连接，重组质粒转化受体菌TOP10获得了Amp抗性菌落。经PCR检测及Bsp1407Ⅰ与NdeⅠ的单酶切和双酶切鉴定，筛选到了阳性克隆，相应的重组质粒被命名为pBAD-LRCP。序列测定表明PLRV-CP基因与载体正向连接、密码子阅读正确，但构建的工程菌TOP10(pBAD-LRCP)经阿拉伯糖诱导后没有预期的表达蛋白。用pBAD-LRCP作模板，经PCR，删除了PLRV-CP基因中126bp的富含精氨酸密码的DNA片段，获得了带有突变基因的质粒pBAD-LRCP-126。在37℃，缺失突变体TOP10(pBAD-LRCP-126)用0.2％阿拉伯糖诱导培养4小时后，SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条34kDa的特异性蛋白条带，其大小与预期的融合蛋白相符。Western blotting分析结果显示该融合蛋白与国际马铃薯中心(CIP)提供的PLRV-IgG有反应，形成明显的杂交带，表明该融合蛋白是突变基因正确表达的产物。用溶菌酶裂解菌体，提取总蛋白，SDS-PAGE显示表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在。包涵体蛋白经含8M尿素的结合缓冲液溶解后，用金属亲和层析法进行纯化，获得了高纯度的目的蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔制备出了抗血清。琼脂糖双向扩散检测显示抗血清的效价1：256，间接ELISA测得的效价1：12800，结果显示获得了融合蛋白的特异性抗血清。用该抗血清对病叶进行间接ELISA检测，结果呈阳性，表明制备的抗血清可用于PLRV的检测。