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【目的】
检测从健康婴儿粪便中分离得到的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei, LP)生物学特性，评价其安全性，探究其对DSS诱导小鼠结肠炎的免疫调节作用，为该菌用于临床治疗溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)提供实验依据。
【方法】
首先采用厌氧培养法和革兰染色法观察副干酪乳杆菌R2、R3和R4的菌落和菌体形态及采用分光光度法测定菌株的生长曲线。采用微孔板法和胃肠液耐受性实验筛选出具有最大生物被膜形成能力及胃肠液耐受性的菌株。采用溶血实验和动物实验评价筛选出的副干酪乳杆菌R3的安全性。将小鼠随机分为5组：正常组(NS组)、模型组(DSS组)、副干酪乳杆菌R3组(LPR3组)、美沙拉嗪组(MSLZ组)、副干酪乳杆菌R3联合美沙拉嗪组(LPR3+MSLZ组)。NS组正常饮水，其余各组小鼠饮用葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液7天建立结肠炎模型。每天记录小鼠一般情况，计算疾病活动指数(DAI)。造模第8天处死小鼠，检测小鼠结肠长度及脾脏质量变化，观察小鼠结肠组织病理学改变，结合免疫组织化学法、免疫印迹法和液相芯片等方法检测小鼠Th17和Tregs细胞相关标志物的表达。
【结果】
1.副干酪乳杆菌的生物学特性：副干酪乳杆菌R2、R3和R4在MRS琼脂平板上的菌落呈乳白色，圆形，表面光滑，边缘整齐。革兰染色阳性，杆菌，单个或成对排列，部分呈短链排列。三株菌均在18h达对数末期且24h达稳定期，但副干酪乳杆菌R3分裂增殖速度较副干酪乳杆菌R2和R4慢。副干酪乳杆菌R3具有中等强度的生物被膜形成能力，而副干酪乳杆菌R2和R4不黏附成膜。胃肠液耐受性实验中，副干酪乳杆菌R3在pH=2.0的胃肠液消化6h后，其存活率仍达43.08±0.27%，并且分别在pH=3.0、4.0和7.0的胃肠液消化6h后，其存活率均能达70%以上。
2.副干酪乳杆菌R3的安全性评价：R3株在血琼脂平板中培养无溶血现象。该菌喂养期间，小鼠一般情况正常，未出现死亡且体重、脏器指数、血糖含量与对照组相比均无显著性差异。
3.小鼠的一般情况及DAI评分：与NS组相比，DSS组在造模第4天开始出现体重下降，从第5天起，LPR3+MSLZ组与DSS组相比，体重下降明显减少，腹泻、便血情况减轻。造模第2天起，DSS组DAI评分随天数增长不断增高。LPR3组DAI评分降低，LPR3+MSLZ组DAI评分降低更明显。
4.小鼠结肠和脾脏变化：与各组相比，DSS组小鼠的结肠长度明显缩短，脾脏明显肿大，脾脏指数显著增高。LPR3组、MSLZ组与DSS组相比，结肠长度恢复，脾脏肿大减轻，脾脏指数降低，LPR3+MSLZ组恢复更显著。
5.小鼠结肠组织病理学改变：DSS组小鼠结肠组织腺体排列紊乱，大量炎症细胞浸润，组织学损伤评分显著高于其他各组。与DSS组相比，LPR3组、MSLZ组小鼠结肠组织破坏减轻，炎症细胞浸润减少，组织学损伤评分降低，LPR3+MSLZ组则缓解更明显。
6.小鼠血清中细胞因子的含量：LPR3组、MSLZ组和LPR3+MSLZ组IFN-γ、IL-17A、IL-17F的含量显著低于DSS组，IL-10的水平显著高于DSS组。LPR3组IL-17A/IL-10的值显著低于DSS组，LPR3+MSLZ组降低更显著。
7.Th17和Tregs细胞标志物在小鼠结肠组织中的表达：免疫组织化学法结果显示，LPR3组IFN-γ和IL-17A阳性评分显著低于DSS组，LPR3+MSLZ组降低更显著；LPR3组Foxp3和IL-10阳性评分显著高于DSS组，LPR3+MSLZ组升高更显著。免疫印迹法结果显示，LPR3组CD4、CD25和Foxp3的表达均高于DSS组，LPR3+MSLZ组升高更显著；LPR3组IFN-γ和IL-17A的表达显著低于DSS组，LPR3+MSLZ组降低更显著。
【结论】
三株副干酪乳杆菌中，R3株生物被膜形成能力最强，且具有较好的胃肠液耐受性以及良好的安全性；R3株和MSLZ均能缓解小鼠结肠炎症状，且两者联合用药治疗效果优于单独用药；R3株可显著抑制IFN-γ、IL-17A、IL-17F等促炎因子的产生，促进抑炎因子IL-10的产生，提示R3株可能通过调节Th17/Tregs细胞平衡来发挥免疫调节作用，进而缓解小鼠结肠炎症状。
检测从健康婴儿粪便中分离得到的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei, LP)生物学特性，评价其安全性，探究其对DSS诱导小鼠结肠炎的免疫调节作用，为该菌用于临床治疗溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)提供实验依据。
【方法】
首先采用厌氧培养法和革兰染色法观察副干酪乳杆菌R2、R3和R4的菌落和菌体形态及采用分光光度法测定菌株的生长曲线。采用微孔板法和胃肠液耐受性实验筛选出具有最大生物被膜形成能力及胃肠液耐受性的菌株。采用溶血实验和动物实验评价筛选出的副干酪乳杆菌R3的安全性。将小鼠随机分为5组：正常组(NS组)、模型组(DSS组)、副干酪乳杆菌R3组(LPR3组)、美沙拉嗪组(MSLZ组)、副干酪乳杆菌R3联合美沙拉嗪组(LPR3+MSLZ组)。NS组正常饮水，其余各组小鼠饮用葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液7天建立结肠炎模型。每天记录小鼠一般情况，计算疾病活动指数(DAI)。造模第8天处死小鼠，检测小鼠结肠长度及脾脏质量变化，观察小鼠结肠组织病理学改变，结合免疫组织化学法、免疫印迹法和液相芯片等方法检测小鼠Th17和Tregs细胞相关标志物的表达。
【结果】
1.副干酪乳杆菌的生物学特性：副干酪乳杆菌R2、R3和R4在MRS琼脂平板上的菌落呈乳白色，圆形，表面光滑，边缘整齐。革兰染色阳性，杆菌，单个或成对排列，部分呈短链排列。三株菌均在18h达对数末期且24h达稳定期，但副干酪乳杆菌R3分裂增殖速度较副干酪乳杆菌R2和R4慢。副干酪乳杆菌R3具有中等强度的生物被膜形成能力，而副干酪乳杆菌R2和R4不黏附成膜。胃肠液耐受性实验中，副干酪乳杆菌R3在pH=2.0的胃肠液消化6h后，其存活率仍达43.08±0.27%，并且分别在pH=3.0、4.0和7.0的胃肠液消化6h后，其存活率均能达70%以上。
2.副干酪乳杆菌R3的安全性评价：R3株在血琼脂平板中培养无溶血现象。该菌喂养期间，小鼠一般情况正常，未出现死亡且体重、脏器指数、血糖含量与对照组相比均无显著性差异。
3.小鼠的一般情况及DAI评分：与NS组相比，DSS组在造模第4天开始出现体重下降，从第5天起，LPR3+MSLZ组与DSS组相比，体重下降明显减少，腹泻、便血情况减轻。造模第2天起，DSS组DAI评分随天数增长不断增高。LPR3组DAI评分降低，LPR3+MSLZ组DAI评分降低更明显。
4.小鼠结肠和脾脏变化：与各组相比，DSS组小鼠的结肠长度明显缩短，脾脏明显肿大，脾脏指数显著增高。LPR3组、MSLZ组与DSS组相比，结肠长度恢复，脾脏肿大减轻，脾脏指数降低，LPR3+MSLZ组恢复更显著。
5.小鼠结肠组织病理学改变：DSS组小鼠结肠组织腺体排列紊乱，大量炎症细胞浸润，组织学损伤评分显著高于其他各组。与DSS组相比，LPR3组、MSLZ组小鼠结肠组织破坏减轻，炎症细胞浸润减少，组织学损伤评分降低，LPR3+MSLZ组则缓解更明显。
6.小鼠血清中细胞因子的含量：LPR3组、MSLZ组和LPR3+MSLZ组IFN-γ、IL-17A、IL-17F的含量显著低于DSS组，IL-10的水平显著高于DSS组。LPR3组IL-17A/IL-10的值显著低于DSS组，LPR3+MSLZ组降低更显著。
7.Th17和Tregs细胞标志物在小鼠结肠组织中的表达：免疫组织化学法结果显示，LPR3组IFN-γ和IL-17A阳性评分显著低于DSS组，LPR3+MSLZ组降低更显著；LPR3组Foxp3和IL-10阳性评分显著高于DSS组，LPR3+MSLZ组升高更显著。免疫印迹法结果显示，LPR3组CD4、CD25和Foxp3的表达均高于DSS组，LPR3+MSLZ组升高更显著；LPR3组IFN-γ和IL-17A的表达显著低于DSS组，LPR3+MSLZ组降低更显著。
【结论】
三株副干酪乳杆菌中，R3株生物被膜形成能力最强，且具有较好的胃肠液耐受性以及良好的安全性；R3株和MSLZ均能缓解小鼠结肠炎症状，且两者联合用药治疗效果优于单独用药；R3株可显著抑制IFN-γ、IL-17A、IL-17F等促炎因子的产生，促进抑炎因子IL-10的产生，提示R3株可能通过调节Th17/Tregs细胞平衡来发挥免疫调节作用，进而缓解小鼠结肠炎症状。