【摘 要】
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目的:探究miR-423-5p在内皮细胞增殖和迁移中的作用及分子机制。方法:1.分别转染agomiR-423-5p、antagomiR-423-5p及其阴性对照进入人脐静脉内皮细胞内。采用EDU、Western-blot实验检测内皮细胞增殖相关蛋白CD105（Endoglin）表达、划痕实验、Transwell实验观察miR-423-5p对内皮细胞增殖和迁移的影响;2.通过生物信息学工具（http
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目的:探究miR-423-5p在内皮细胞增殖和迁移中的作用及分子机制。方法:1.分别转染agomiR-423-5p、antagomiR-423-5p及其阴性对照进入人脐静脉内皮细胞内。采用EDU、Western-blot实验检测内皮细胞增殖相关蛋白CD105（Endoglin）表达、划痕实验、Transwell实验观察miR-423-5p对内皮细胞增殖和迁移的影响;2.通过生物信息学工具（http://www.targetscan.org）预测miR-423-5p的靶基因为S1PR1。采用双荧光素酶基因报告实验验证miR-423-5p 与 S1PR1（Sphingosine 1-phosphate receptor 1）的 3’UTR（3’非翻译区）的相互作用。采用Western-blot实验分析S1PR1及其下游蛋白 eNOS（endothelial nitric oxide synthase）的表达情况;3.在人脐静脉内皮细胞内通过共转染的方法同时敲低miR-423-5p及其靶基因S1PR1,通过挽救实验（rescue）策略进行增殖和迁移表型实验以揭示S1PR1介导的生物学作用。结果:1.EDU实验检测细胞的增殖活性,结果显示:高表达miR-423-5p明显抑制细胞的增殖能力,低表达miR-423-5p明显促进细胞的增殖能力。Western-blot免疫印迹实验结果显示,过表达miR-423-5p后CD105蛋白的表达明显下降,而低表达miR-423-5p后CD105蛋白的表达明显增加。划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移能力,划痕实验结果显示,在划痕24h后,与对照组相比,高表达miR-423-5p组的细胞迁移数目明显减少,而低表达miR-423-5p组的细胞迁移数目明显增加。Transwell实验结果显示,与对照组相比,高表达miR-423-5p组的细胞在48h内穿透聚碳酸脂膜的细胞数量明显减少,而低表达miR-423-5p组的细胞在48h内穿透聚碳酸脂膜的细胞数量显著增加,提示miR-423-5p能明显抑制人脐静脉内皮细胞的迁移。2.运用TargetScan软件推测出S1PR1是miR-423-5p的下游预测靶基因。双荧光素酶报告实验结果显示,过表达miR-423-5p显著抑制了与S1PR1野生型3’UTR融合的荧光素酶活性（P＜0.01）,提示miR-423-5p可以直接与S1PR1的3’UTR结合并调节其表达。Western-blot免疫印迹实验结果显示,过表达miR-423-5p后S1PR1和eNOS蛋白的表达明显下降,而低表达miR-423-5p后S1PR1和eNOS蛋白的表达明显增加。3.Western-blot免疫印迹实验结果显示,低表达miR-423-5p能够上调S1PR1的表达,而同时低表达miR-423-5p和S1PR1能够显著降低S1PR1蛋白的表达,提示共转染效率较好。EDU实验结果显示,与低表达miR-423-5p组相比,双敲miR-423-5p和S1PR1组Edu阳性细胞的比例（绿色）显著减少了,提示低表达S1PR1能够消除低表达miR-423-5p促进细胞增殖的能力。Western-blot免疫印迹实验结果显示,低表达miR-423-5p能够上调CD105蛋白的表达,而同时低表达miR-423-5p和S1PR1能够显著降低CD105蛋白的表达。划痕实验结果显示,与低表达miR-423-5p组相比,双敲miR-423-5p和S1PR1组细胞迁移数量明显减少,提示低表达S1PR1能够消除低表达miR-423-5p促进细胞迁移的能力。Transwell实验结果显示,与低表达miR-423-5p组相比,双敲miR-423-5p和S1PR1组细胞穿透聚碳酸脂膜的细胞数量明显减少,同样提示低表达S1PR1能够消除低表达miR-423-5p促进细胞迁移的能力。结论:miR-423-5p通过靶向S1PR1/eNOS信号通路抑制内皮细胞的增殖和迁移。
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