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摘要： 为了更好的培育大量使用的过氧化氢酶，需要对其高产菌株EIM-70进行仔细的鉴定，确定其所属于的细菌种类。从而更精准的确定高产菌株EIM-70最适宜的培育条件。本文将通过介绍整个实验过程，即Plackett实验法，筛选出对于培育酶影响比较大的银子，再通过最陡爬坡实验以及响应面的分析最终确定酶的培养基条件。从而为今后工业化培育过氧化氢酶提供了珍贵的指导和理论基础。
关键词：过氧化氢酶；EIM-70；培养基
过氧化氢H2O2是一种常见的代谢废物，也是漂白剂。这种物质广泛存在，但具有一定的毒性，因而需要在实际生活中尽量减少其和人体接触的机会，防止对人身体造成伤害。促进过氧化氢分解生成水和氧气是常用的处理方法，而过氧化氢酶就是促进过氧化氢分解的优质催化剂。过氧化氢酶来源广泛，来源于生物体，对人类无害，因此，在食品加工和漂白处理上，过氧化氢酶都已经被广泛使用。但随着工业进程的发展，企业规模越来越大，过氧化氢酶的工业化生成显得十分必要。因此，人们把目光集中在了过氧化氢酶的高产菌株EIM-70上了。为了让这种菌株更好、更快地培养出各种过氧化氢酶，就必须确定这种菌株的种类特性，本文就将通过实验过程和结果的描述，确定这种菌株的培养环境。
1.过氧化氢酶
过氧化氢酶也叫触酶（CAT）。首先在1901年被Thenard发现，由Loew命名成过氧化氢酶。1937年生物化学家Summer等人联手从牛的肝脏中，提取分离得到了过氧化氢酶的结晶体，这也是几种人类最早通过分离制备得到的高纯度生物酶之一。这种酶对于过氧化氢分解成水喝氧气的反应具有十分出色的催化作用。而且这种酶的来源十分广泛，除了厌氧生物以外，几乎所有的生物体内均有分布。这种酶的用途也很明确，即清除自由基、防止过氧根离子上伤害细胞等。目前已经在食品、医药等多个行业推广应用[1]。
CAT也可以被运用在棉织物的前期处理过程中。因为棉织物需要用到大量的过氧化氢进行漂白，所以漂白之后棉织物上会残留部分过氧化氢。而在实际操作中，就可以通过添加CAT，促进棉织物上残留的过氧化氢进行分解反应，保护人的身体不被过氧化氢做侵害。
目前市面上的CAT多来源于动物和微生物，相对于从动植物体内提取CAT来说，微生物发酵提取CAT的成本极低、周期短而且培养条件十分简单。但是国内对于这中微生物培养过氧化氢酶的研究还处于理论研究阶段，很少有真正用于工业化生产的产品。
本文通过形态学方法和16S rDNA的序列分析对EIM-70这种高产菌株进行鉴定，通过对鉴定结果的分析优化EIM-70的培养条件，为国内的微生物培养过氧化氢酶的功业进程提供一些参考[2]。
2.实验材料及方法
2.1材料
本次实验包含的材料如下：
（1）菌株
EIM-70菌株、Escherichia coil DH5α、pMD 18-T Vector
（2）培养基
本次实验采用6度的麦芽汁作为实验的液体培养基。用2%的琼脂凝固后的凝胶作为固体斜面培养基。同时加入10g葡萄糖、5g硝酸钠、0.0025g的五水硫酸亚铁、0.5g的七水硫酸镁、9.25g12水磷酸一氢纳、和0.6g的磷酸二氢钾，并定容至1L后的溶液，作为本次实验的初始发酵培养基。
2.2试验方法
本次实验的方法包括以下几个方面：
（1）菌株形态观察法。将高产菌株EIM-70放在琼脂做成的固体平板培养基上，对菌株的结晶进行染紫色的操作之后，再把菌株放到显微镜井口下进行观察。通过对菌株形体特征的观察，初步对菌株的种类进行鉴定。
（2）16S rDNA菌株克隆及核苷酸排列测序。参考细菌的16S rDNA保守序列的设计通用引物作为方法的参考。将菌株的总基因组DNA作为复制模板，对该菌株的16S rDNA进行克隆操作。克隆之后，再通过验证确定克隆的准确性，然后提交相关机构，进行DNA的测序工作。
（3）构建系统进化树。利用来源于NCBI数据库里的Blast工具，对过氧化氢酶高产菌株EIM-70进行16S rDNA的序列相似性对比，然后通过MEGA4.0.2软件为其构建系统进化树。
（4）CAT活力测定。在37℃的温度条件下，采用分光光度法，对过氧化氢酶CAT的活力进行测定。取0.1ml的CAT溶液与25mmol/L的磷酸一氢钾-磷酸二氢钾中性缓冲液混合之3ml。充分搅拌之后，用UV-1100型的紫外线分光光度计在240nm的条件下进行测定。CAT的活力单位U定义为：37℃的温度下，每分钟完成1μmol过氧化氢的分解，所耗费的CAT量为1CAT活力单位。
3.实验结果
3.1过氧化氢高产酶EIM-70的鉴定
（1）菌株形态。通过显微镜的观察可知，EIM-70呈现明显的短杆形状或者呈完全的杆状，菌株上有芽孢，芽孢的位置在细菌整体的中央处或者稍微偏离中心的地方，芽孢呈现圆形或者椭圆形的形态。这时对比《伯杰细菌鉴定手册》对于各种细菌形态的描述，可以很清楚的得知，杆状外观与芽孢的分布与典型的芽孢杆菌特征完全一致，也就可以初步认为EIM-70属于芽孢杆菌属[3]。
（2）16S rDNA核苷酸序列分析。通过对芽孢杆菌进行克隆之后的样品进行测序，EIM-70的测序结果表明其长度为1488bp，基本上与PCR结果保持一致。而接下来的Blast相似性对比试验的结果表明，过氧化氢酶高产菌株EIM-70的核苷酸序列与Blast数据库中的Bacilus suntilis strain CD-25的核苷酸序列具有十分高的相似性，相似性超过了99%，基本可以确认为一类。然后运用ClustalX1.83软件，选取11种不同来源的序列进行对比，并在MEGA4.0.2平台上，生成EIM-70的进化树，最终结果表面过氧化氢酶高产菌株EIM-70是枯草芽孢杆菌[4]。 3.2培养基优化
（1）最佳碳源的确定。将配置好的初始发酵培养基作为实验基础，然后选取葡萄糖、蔗糖等8种可作为细菌培养碳源的物质作为实验碳源。每种碳源分成3组相同的平行试验样本，每一种碳源重复试验3次，通过对每一组碳源的CTA活力进行测定，以确定EIM-70菌株的最佳培养碳源。由试验结果可知，在碳源是葡萄糖的情况下，CAT的活力为 （ 2 653.15 ±40.26）U/ml，明显高出其余7种碳源，也就说，EIM-70的最佳培养碳源为葡萄糖。
（2）最佳氮源的确定。同样以配置好的初始发酵培养基作为实验的基础，选择硝酸钠、尿素等8种含氮物质作为实验氮源。与碳源确定实验一样，每组设置3个平行实验，每个氮源重复三遍实验，通过每种氮源CAT活力的不同，确定CAT培养的最佳氮源。由实验结果可知，当EIM-70的氮源是硝酸钠时，其CAT活力达到（3544.61±149.55）U/ml，超过排在第二的磷酸氨1倍还多，可以确定硝酸钠是EIM-70菌株进行酶培育时的最佳氮源。
（3）Plackett-Burman实验。该实验的目的是探究哪些因素对于EIM-70酶的活力具有最大的影响力。在本次实验中，以最佳碳源和最佳氮源的单因子实验作为实验基础，采用8个因素，N=12，并重复进行三次的Plackett-Burman实验。8个因素分别为：葡萄糖、硝酸钠、对照因子、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁、十二水磷酸一氢钠、磷酸二氢钾、麦芽汁的度数，对这八个因子分别编号为：X1 、X2 、X3 、X4 、X5 、X6 、X7 、X8。然后，对于每个因素分别选取+1的高水平和-1的低水平两个水平值，而响应值Y为发酵过程中的CAT活力大小。通过对实验结果进行制表和分析，可以很清晰得知，X1 、X3 、X4这三个因素，即葡萄糖、硝酸钠和七水硫酸亚铁是影响EIM-70进行发酵时酶活力大小的显著因素，置信度分别达到了98.52%、98.46%和96.84%。然后选择葡萄糖、硝酸钠和七水硫酸亚铁完成中心组和设计，并进行响应面分析，其它不重要因素则选择固定值。最后用SAS9.2软件对实验进行分析[5]。
（4）最陡爬坡实验。该实验的实验因子就是Plackett-Burman实验中得出的限制因子，也就是葡萄糖、硝酸钠和七水硫酸亚铁。因子的步长取决于一次多元线性编码组成的方程式中变量的系数，而因子的方向也决定于此。因子的大小决定步长而因此的符号改变因子的方向。实验结果表明，在最陡路径上升到第4步之后，CAT的活力停止提高，所以算着这个点进行中心组合优化实验，进行响应面分析。
（5）实验结果验证试验。之前一系列试验所得出的实验结果，仅仅是理论验证，对于其实际效果还要通过试验进行验证。也就是按照实验得出来的最优发酵条件进行EIM-70菌株的发酵试验，并重复3次平行试验。实际实验操作得出的最优条件下CAT活力值为6 927.45 U/ml。与理论计算值对比，显然实际值略低于试验的理论预测值，但是两者的差距并不大，所以试验比较好的验证了试验结果，证明之前实验得出的EIM-70菌株培养基的优化条件是真实可靠的，也是可以被推广的。
4.结束语
本文阐述了实验形态观察、16S rDNA鉴定等一系列试验方法确定过氧化氢高产菌株EIM-70的种属，并最终确定其最优化的培养基条件。得出的重要结论包括EIM-70属于枯草芽孢杆菌，葡萄糖、硝酸纳和七水硫酸亚铁是影响EIM-70发酵的主要因素，并最终得到了培养过氧化氢酶CAT的最佳培养基配比条件。无论是实验过程还是实验的最终结果，对于实际的工业生产，均具有十分重要的参考意义。
参考文献：
[1]段绪果.可控裂解的产耐热过氧化氢酶基因工程菌的构建[D].江南大学，2006，02：58.
[2]刘灵芝，钟广蓉，熊莲，等.过氧化氢酶高的研究与应用新进展[J].化学与生物工程，2009，03：26.
[3]赵志军，华兆哲，刘登如，等.碱性过氧化氢酶高产菌的筛选、鉴定及发酵条件优化[J].微生物学通报，2007，04：35.
[4]邓玉，敬海明，成丽丽，等.韭菜过氧化氢酶的分离纯化及其部分酶学特性[J].食品科学，2011，9：31.
关键词：过氧化氢酶；EIM-70；培养基
过氧化氢H2O2是一种常见的代谢废物，也是漂白剂。这种物质广泛存在，但具有一定的毒性，因而需要在实际生活中尽量减少其和人体接触的机会，防止对人身体造成伤害。促进过氧化氢分解生成水和氧气是常用的处理方法，而过氧化氢酶就是促进过氧化氢分解的优质催化剂。过氧化氢酶来源广泛，来源于生物体，对人类无害，因此，在食品加工和漂白处理上，过氧化氢酶都已经被广泛使用。但随着工业进程的发展，企业规模越来越大，过氧化氢酶的工业化生成显得十分必要。因此，人们把目光集中在了过氧化氢酶的高产菌株EIM-70上了。为了让这种菌株更好、更快地培养出各种过氧化氢酶，就必须确定这种菌株的种类特性，本文就将通过实验过程和结果的描述，确定这种菌株的培养环境。
1.过氧化氢酶
过氧化氢酶也叫触酶（CAT）。首先在1901年被Thenard发现，由Loew命名成过氧化氢酶。1937年生物化学家Summer等人联手从牛的肝脏中，提取分离得到了过氧化氢酶的结晶体，这也是几种人类最早通过分离制备得到的高纯度生物酶之一。这种酶对于过氧化氢分解成水喝氧气的反应具有十分出色的催化作用。而且这种酶的来源十分广泛，除了厌氧生物以外，几乎所有的生物体内均有分布。这种酶的用途也很明确，即清除自由基、防止过氧根离子上伤害细胞等。目前已经在食品、医药等多个行业推广应用[1]。
CAT也可以被运用在棉织物的前期处理过程中。因为棉织物需要用到大量的过氧化氢进行漂白，所以漂白之后棉织物上会残留部分过氧化氢。而在实际操作中，就可以通过添加CAT，促进棉织物上残留的过氧化氢进行分解反应，保护人的身体不被过氧化氢做侵害。
目前市面上的CAT多来源于动物和微生物，相对于从动植物体内提取CAT来说，微生物发酵提取CAT的成本极低、周期短而且培养条件十分简单。但是国内对于这中微生物培养过氧化氢酶的研究还处于理论研究阶段，很少有真正用于工业化生产的产品。
本文通过形态学方法和16S rDNA的序列分析对EIM-70这种高产菌株进行鉴定，通过对鉴定结果的分析优化EIM-70的培养条件，为国内的微生物培养过氧化氢酶的功业进程提供一些参考[2]。
2.实验材料及方法
2.1材料
本次实验包含的材料如下：
（1）菌株
EIM-70菌株、Escherichia coil DH5α、pMD 18-T Vector
（2）培养基
本次实验采用6度的麦芽汁作为实验的液体培养基。用2%的琼脂凝固后的凝胶作为固体斜面培养基。同时加入10g葡萄糖、5g硝酸钠、0.0025g的五水硫酸亚铁、0.5g的七水硫酸镁、9.25g12水磷酸一氢纳、和0.6g的磷酸二氢钾，并定容至1L后的溶液，作为本次实验的初始发酵培养基。
2.2试验方法
本次实验的方法包括以下几个方面：
（1）菌株形态观察法。将高产菌株EIM-70放在琼脂做成的固体平板培养基上，对菌株的结晶进行染紫色的操作之后，再把菌株放到显微镜井口下进行观察。通过对菌株形体特征的观察，初步对菌株的种类进行鉴定。
（2）16S rDNA菌株克隆及核苷酸排列测序。参考细菌的16S rDNA保守序列的设计通用引物作为方法的参考。将菌株的总基因组DNA作为复制模板，对该菌株的16S rDNA进行克隆操作。克隆之后，再通过验证确定克隆的准确性，然后提交相关机构，进行DNA的测序工作。
（3）构建系统进化树。利用来源于NCBI数据库里的Blast工具，对过氧化氢酶高产菌株EIM-70进行16S rDNA的序列相似性对比，然后通过MEGA4.0.2软件为其构建系统进化树。
（4）CAT活力测定。在37℃的温度条件下，采用分光光度法，对过氧化氢酶CAT的活力进行测定。取0.1ml的CAT溶液与25mmol/L的磷酸一氢钾-磷酸二氢钾中性缓冲液混合之3ml。充分搅拌之后，用UV-1100型的紫外线分光光度计在240nm的条件下进行测定。CAT的活力单位U定义为：37℃的温度下，每分钟完成1μmol过氧化氢的分解，所耗费的CAT量为1CAT活力单位。
3.实验结果
3.1过氧化氢高产酶EIM-70的鉴定
（1）菌株形态。通过显微镜的观察可知，EIM-70呈现明显的短杆形状或者呈完全的杆状，菌株上有芽孢，芽孢的位置在细菌整体的中央处或者稍微偏离中心的地方，芽孢呈现圆形或者椭圆形的形态。这时对比《伯杰细菌鉴定手册》对于各种细菌形态的描述，可以很清楚的得知，杆状外观与芽孢的分布与典型的芽孢杆菌特征完全一致，也就可以初步认为EIM-70属于芽孢杆菌属[3]。
（2）16S rDNA核苷酸序列分析。通过对芽孢杆菌进行克隆之后的样品进行测序，EIM-70的测序结果表明其长度为1488bp，基本上与PCR结果保持一致。而接下来的Blast相似性对比试验的结果表明，过氧化氢酶高产菌株EIM-70的核苷酸序列与Blast数据库中的Bacilus suntilis strain CD-25的核苷酸序列具有十分高的相似性，相似性超过了99%，基本可以确认为一类。然后运用ClustalX1.83软件，选取11种不同来源的序列进行对比，并在MEGA4.0.2平台上，生成EIM-70的进化树，最终结果表面过氧化氢酶高产菌株EIM-70是枯草芽孢杆菌[4]。 3.2培养基优化
（1）最佳碳源的确定。将配置好的初始发酵培养基作为实验基础，然后选取葡萄糖、蔗糖等8种可作为细菌培养碳源的物质作为实验碳源。每种碳源分成3组相同的平行试验样本，每一种碳源重复试验3次，通过对每一组碳源的CTA活力进行测定，以确定EIM-70菌株的最佳培养碳源。由试验结果可知，在碳源是葡萄糖的情况下，CAT的活力为 （ 2 653.15 ±40.26）U/ml，明显高出其余7种碳源，也就说，EIM-70的最佳培养碳源为葡萄糖。
（2）最佳氮源的确定。同样以配置好的初始发酵培养基作为实验的基础，选择硝酸钠、尿素等8种含氮物质作为实验氮源。与碳源确定实验一样，每组设置3个平行实验，每个氮源重复三遍实验，通过每种氮源CAT活力的不同，确定CAT培养的最佳氮源。由实验结果可知，当EIM-70的氮源是硝酸钠时，其CAT活力达到（3544.61±149.55）U/ml，超过排在第二的磷酸氨1倍还多，可以确定硝酸钠是EIM-70菌株进行酶培育时的最佳氮源。
（3）Plackett-Burman实验。该实验的目的是探究哪些因素对于EIM-70酶的活力具有最大的影响力。在本次实验中，以最佳碳源和最佳氮源的单因子实验作为实验基础，采用8个因素，N=12，并重复进行三次的Plackett-Burman实验。8个因素分别为：葡萄糖、硝酸钠、对照因子、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁、十二水磷酸一氢钠、磷酸二氢钾、麦芽汁的度数，对这八个因子分别编号为：X1 、X2 、X3 、X4 、X5 、X6 、X7 、X8。然后，对于每个因素分别选取+1的高水平和-1的低水平两个水平值，而响应值Y为发酵过程中的CAT活力大小。通过对实验结果进行制表和分析，可以很清晰得知，X1 、X3 、X4这三个因素，即葡萄糖、硝酸钠和七水硫酸亚铁是影响EIM-70进行发酵时酶活力大小的显著因素，置信度分别达到了98.52%、98.46%和96.84%。然后选择葡萄糖、硝酸钠和七水硫酸亚铁完成中心组和设计，并进行响应面分析，其它不重要因素则选择固定值。最后用SAS9.2软件对实验进行分析[5]。
（4）最陡爬坡实验。该实验的实验因子就是Plackett-Burman实验中得出的限制因子，也就是葡萄糖、硝酸钠和七水硫酸亚铁。因子的步长取决于一次多元线性编码组成的方程式中变量的系数，而因子的方向也决定于此。因子的大小决定步长而因此的符号改变因子的方向。实验结果表明，在最陡路径上升到第4步之后，CAT的活力停止提高，所以算着这个点进行中心组合优化实验，进行响应面分析。
（5）实验结果验证试验。之前一系列试验所得出的实验结果，仅仅是理论验证，对于其实际效果还要通过试验进行验证。也就是按照实验得出来的最优发酵条件进行EIM-70菌株的发酵试验，并重复3次平行试验。实际实验操作得出的最优条件下CAT活力值为6 927.45 U/ml。与理论计算值对比，显然实际值略低于试验的理论预测值，但是两者的差距并不大，所以试验比较好的验证了试验结果，证明之前实验得出的EIM-70菌株培养基的优化条件是真实可靠的，也是可以被推广的。
4.结束语
本文阐述了实验形态观察、16S rDNA鉴定等一系列试验方法确定过氧化氢高产菌株EIM-70的种属，并最终确定其最优化的培养基条件。得出的重要结论包括EIM-70属于枯草芽孢杆菌，葡萄糖、硝酸纳和七水硫酸亚铁是影响EIM-70发酵的主要因素，并最终得到了培养过氧化氢酶CAT的最佳培养基配比条件。无论是实验过程还是实验的最终结果，对于实际的工业生产，均具有十分重要的参考意义。
参考文献：
[1]段绪果.可控裂解的产耐热过氧化氢酶基因工程菌的构建[D].江南大学，2006，02：58.
[2]刘灵芝，钟广蓉，熊莲，等.过氧化氢酶高的研究与应用新进展[J].化学与生物工程，2009，03：26.
[3]赵志军，华兆哲，刘登如，等.碱性过氧化氢酶高产菌的筛选、鉴定及发酵条件优化[J].微生物学通报，2007，04：35.
[4]邓玉，敬海明，成丽丽，等.韭菜过氧化氢酶的分离纯化及其部分酶学特性[J].食品科学，2011，9：31.