论文部分内容阅读
摘要：目的：检测SIGIRR、NF-κB p65 在UC患者结肠黏膜的表达，探讨其在UC发病机制中的作用及相互关系。方法：采用免疫组化SP法检测32例UC内镜活检标本和16例正常对照组织中SIGIRR、NF-κB p65的表达情况。结果： UC 组织NF-κB p65蛋白表达高于正常对照（P<0.01）；SIGIRR在UC组织表达低于正常对照（P<0.05）。NF-κB p65表达与病理分级正相关，SIGIRR 表达与病理分级负相关，NF-κB p65和SIGIRR的表达呈显著负相关（P<0.05）。结论：SIGIRR可能通过作用于NF-κB p65信号通路影响UC炎症的发生发展。
关键词：溃疡性结肠炎；核转录因子KappaB；免疫球蛋白单体IL-1受体相关分子（SIGIRR）
溃疡性结肠炎（UC）的病因和发病机制尚不清楚，目前认为可能是肠道细菌及其代谢产物作用于基因易感性宿主使之产生异常的免疫反应所致，核因子κB（NF-κB p65）是UC发病过程中最重要的调控因子[1]，可促进多种炎性细胞因子的转录[2]，因此，NF-κB p65信号通路的活化必须受到严密的控制。SIGIRR（Translation initiation region 8）是新近發现的负性调节因子，但是在UC组织中二者关系如何未见报道。因此，我们检测NF-κB p65和SIGIRR在UC 结肠黏膜的表达和分布， 探讨他们在UC 发病机制中的作用及相互关系。
1 .资料与方法
1.1 研究对象
1、溃疡性结肠炎组 纳入标准：我院UC的患者32例，男21例，女10例，平均年龄：36.78（20～70）岁。UC的诊断标准为2000年全国炎症性肠病学术会议（成都）的制定的诊断标准[2]，病理分级根据Truelove-Richards标准[3]，分为Ⅰ～Ⅲ级，其中Ⅰ级10例、Ⅱ级11例、Ⅲ级12例。
2、对照组 纳入标准：结肠镜检查肠黏膜正常或为单发性结肠息肉患者16例，男9例，女8例，平均年龄：38.17（20～69）岁。
1.2 试剂：
兔抗人NF-κBP65单克隆抗体（Santa Crutz公司），兔抗人SIGIRR多克隆抗体（ABCAM公司），SP-9003免疫组化试剂盒（ZYMED公司），聚合酶辅助剂和辣根酶标记的二抗（北京中杉金桥生物制品公司）
1.3 检测方法
内镜下取材UC患者经结肠镜钳取病变最显著肠黏膜组织4块，对照组取直肠黏膜或肠镜下选择距单发性息肉5CM以上的肠段黏膜组织4块，并经病理学确认为正常的结肠黏膜组织。肠黏膜经10%甲醛固定后，常规石蜡包埋，4um连续切片。采用SP免疫组化法染色。结果判断以细胞膜或胞浆染呈黄色至棕褐色为阳性细胞，无着色为阴性。分别观察细胞染色强度及阳性细胞百分数。采用定量积分法[5]。
1.4 统计学处理
所有资料为等级资料，多组之间比较采用H检验（Kruskal-Wallis法）；组与组间的比较采用秩和检验；各指标之间的相关性用Spearman等级相关分析。用SPSS18.0统计软件分析。
2. 结果
2.1 NF-κB p65表达与溃疡性结肠炎及其严重程度的关系
免疫组化染色显示NF-κB p65在正常对照组肠黏膜上皮和固有层只有极少的弱阳性表达。但在UC组肠黏膜表面上皮、隐窝上皮细胞、固有层单个核细胞都有NF-κB p65的高表达，以胞核表达为主。
NF-κB p65在溃疡性结肠炎患者肠黏膜中的表达为30/32（93.7%）显著高于和正常对照者7/16（43.7%）（P<0.001），并且随着病变严重程度加重而增高（表2.1）。
表2.1 对照组及不同严重程度溃疡性结肠炎患者肠黏膜内NF-κB p65的阳性积分比较
注：a为P<0.001 vs 对照组；b为P<0.05 vs UCⅠ级组
2.2SIGIRR表达与溃疡性结肠炎及其严重程度的关系
免疫组化染色显示SIGIRR在正常对照组肠黏膜上皮和固有层均有中等量表达，但在UC组肠黏膜表面上皮、隐窝上皮细胞、固有层单个核细胞均为不表达或弱阳性表达
SIGIRR在溃疡性结肠炎患者肠黏膜中的表达为20/32（62.5%）显著低于正常对照者15/16（93.7%） （P<0.05），并且随着病变严重程度加重而减少（表2.2）。
表2.2 对照组及不同严重程度溃疡性结肠炎患者肠黏膜内SIGIRR的阳性积分比较
注：a为P<0.001 vs 对照组；b为P<0.05 vs UCⅠ级组
2.4溃疡性结肠炎患者肠黏膜中SIGIRR和NF-κB p65表达间的相互关系
经Spearman等级相关分析表明NF-κB p65和SIGIRR的表达呈显著负相关（P<0.05）。
3.讨论
本研究发现NF-κB p65在溃疡性结肠炎肠黏膜上皮细胞和固有层的单核细胞表达增强，呈胞浆和胞核共表达，以胞核表达为主，提示NF-κB p65处于激活状态，且NF-κB p65的表达强度随着肠黏膜炎症的加剧其表达逐渐增加。Neurath 等[6]研究发现IBD患者巨噬细胞内NF-κB活性增加，并伴随促炎细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α的显著增加，而给予NF-κB P65的反义寡核苷酸处理后，随着NF-κB P65下调，促炎因子的水平也下降。Murano等[7]研究发现用NF-κB P65的反义寡核苷酸处理小鼠，可明显改善DSS诱导的小鼠IBD的临床症状和组织学改变，同时降低肠黏膜内促炎细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α水平。这些研究进一步证实了NF-κB的活化在IBD致病中的作用。 研究發现SIGIRR与肠道炎症和免疫反应密切相关[8、 9]。Garlanda等[10 11]研究发现，SIGIRR缺乏小鼠对硫酸葡聚糖钠（Dextran sulfate sodium，DSS）诱发的肠道炎症更为敏感，其黏膜的炎症程度和局部的促炎因子和化学趋化因子水平均显著增加。Xiao等[12]研究也发现SIGIRR缺陷小鼠经DSS处理后肠上皮的炎症反应加重，局部的NF-κB活性和促炎因子（IL-12、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-1β）也显著增加。此结论在另一个实验中也得到证实，即SIGIRR缺乏更容易导致结肠息肉的形成[13]。Naito等[14]用寡核苷酸探针检测了4例克罗恩病和正常人外周血单核细胞在LPS刺激前后多种基因mRNA的表达，发现在克罗恩病患者SIGIRR表达在LSP刺激前后均低于正常人，并且在LPS刺激后显著低于刺激前。提示在克罗恩病患者外周血单核细胞中SIGIRR表达受抑制，而LSP刺激后更加剧了它的抑制。这进一步证实了SIGIRR可能参与了UC的致病。因此，SIGIRR可能是UC治疗的潜在靶点。本研究发现正常对照组肠黏膜上皮细胞及固有层炎症细胞均明显表达SIGIRR，而UC患者肠黏膜表面上皮、隐窝上皮细胞、固有层单个核细胞SIGIRR表达明显减少，显著低于正常肠黏膜，并且随着炎症的加剧其表达逐渐降低。同时SIGIRR与NF-κB p65的表达呈显著负相关（P<0.05），提示SIGIRR可能通过负性调节NF-κB p65通路进行调控，它在正常肠上皮细胞高表达，然而在UC患者肠黏膜中表达低下，这可能是UC患者NF-κB p65信号通路过度激活的机制之一。
NF-κB p65信号通路在UC的发病过程中具有重要作用，随着对其负性调控因子SIGIRR研究的深入，必将为指导治疗UC提供新的思路。
参考文献：
1、Rousseaux C， Desreumaux P. The peroxisome-proliferator-activated gamma receptor and chronic inflammatory bowel disease （PPARgamma and IBD） J Soc Biol. 2006；200（2）：121-31.
2、 龚文亮.惠迪粒对溃疡性结肠炎患者血清IL- 6、TNF- α的影响. 中国医学创新，2013，10（11）：17-18.
3、 中华医学会消化病学分会.对炎症性肠病诊断治疗规范的建议.中华消化杂志2001 21：236-239。
4、施先艳，邓长生.溃疡性结肠炎.见：邓长生，夏冰主编.炎症性肠病.北京：人民卫生出版社，1998.183～189.
5、Sasaki H， Nio M， Iwami D， Funaki N， Sano N， Ohi R， Sasano H. E-cadherin， alpha-catenin and beta-catenin in biliary atresia： correlation with apoptosis and cell cycle. Pathol Int. 2001；51（12）：923-32.
6、Neurath MF， Fuss I， Schürmann G， et al.Cytokine gene transcription by NF-kappa B family members in patients with inflammatory bowel disease. Ann N Y Acad Sci.1998；859：149-159.
7、Murano M， Maemura K， Hirata I， et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B （p65） antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium （DSS）-induced colitis. Clin Exp Immunol. 2000；120（1）：51-58.
8、 Noris M，Cassis P，Azzollini N，et al. The Toll-IL-1R member Tir8/SIGIRR negatively regulates adaptive immunity against kidney grafts[J]. J Immunol，2009，183（7）：4249.
9、 Lech M，Skuginna V，Kulkarni OP，et al.Lack of SIGIRR/TIR8 aggravates hydrocarbon oil-induced lupus nephritis[J].J Pathol，2010，
10、Garlanda C， Riva F， Polentarutti N， et al. Intestinal inflammation in mice deficient in Tir8， an inhibitory member of the IL-1 receptor family. Proc Natl Acad Sci USA. 2004；101（10）： 3522-35266.
11. Garlanda C， Riva F， Veliz T， Polentarutti N， et al. Increased susceptibility to colitis-associated cancer of mice lacking TIR8， an inhibitory member of the interleukin-1 receptor family. Cancer Res. 2008；67（13）：6017-6021
12、Xiao H， Gulen MF， Qin J， et al.The Toll-interleukin-1 receptor member SIGIRR regulates colonic epithelial homeostasis， inflammation， and tumorigenesis. Immunity. 2007；26（4）：461-475.
13、Xiao H，Yin W，Khan MA，et al. Loss of single immunoglobulin interlukin-receptor-related molecule leads to enhanced colonic polyposis in Apc（min） mice[J].Gastroenterology，2010，139（2）：574.
14、Naito Y， Takagi T， Mizushima K， et al. Gene expression clusters of a lipopolysaccharide- stimulated pathway in peripheral blood monocytes of Japanese patients with Crohn's disease. Aliment Pharmacol Ther. 2009；24 Suppl 4：256-265.
关键词：溃疡性结肠炎；核转录因子KappaB；免疫球蛋白单体IL-1受体相关分子（SIGIRR）
溃疡性结肠炎（UC）的病因和发病机制尚不清楚，目前认为可能是肠道细菌及其代谢产物作用于基因易感性宿主使之产生异常的免疫反应所致，核因子κB（NF-κB p65）是UC发病过程中最重要的调控因子[1]，可促进多种炎性细胞因子的转录[2]，因此，NF-κB p65信号通路的活化必须受到严密的控制。SIGIRR（Translation initiation region 8）是新近發现的负性调节因子，但是在UC组织中二者关系如何未见报道。因此，我们检测NF-κB p65和SIGIRR在UC 结肠黏膜的表达和分布， 探讨他们在UC 发病机制中的作用及相互关系。
1 .资料与方法
1.1 研究对象
1、溃疡性结肠炎组 纳入标准：我院UC的患者32例，男21例，女10例，平均年龄：36.78（20～70）岁。UC的诊断标准为2000年全国炎症性肠病学术会议（成都）的制定的诊断标准[2]，病理分级根据Truelove-Richards标准[3]，分为Ⅰ～Ⅲ级，其中Ⅰ级10例、Ⅱ级11例、Ⅲ级12例。
2、对照组 纳入标准：结肠镜检查肠黏膜正常或为单发性结肠息肉患者16例，男9例，女8例，平均年龄：38.17（20～69）岁。
1.2 试剂：
兔抗人NF-κBP65单克隆抗体（Santa Crutz公司），兔抗人SIGIRR多克隆抗体（ABCAM公司），SP-9003免疫组化试剂盒（ZYMED公司），聚合酶辅助剂和辣根酶标记的二抗（北京中杉金桥生物制品公司）
1.3 检测方法
内镜下取材UC患者经结肠镜钳取病变最显著肠黏膜组织4块，对照组取直肠黏膜或肠镜下选择距单发性息肉5CM以上的肠段黏膜组织4块，并经病理学确认为正常的结肠黏膜组织。肠黏膜经10%甲醛固定后，常规石蜡包埋，4um连续切片。采用SP免疫组化法染色。结果判断以细胞膜或胞浆染呈黄色至棕褐色为阳性细胞，无着色为阴性。分别观察细胞染色强度及阳性细胞百分数。采用定量积分法[5]。
1.4 统计学处理
所有资料为等级资料，多组之间比较采用H检验（Kruskal-Wallis法）；组与组间的比较采用秩和检验；各指标之间的相关性用Spearman等级相关分析。用SPSS18.0统计软件分析。
2. 结果
2.1 NF-κB p65表达与溃疡性结肠炎及其严重程度的关系
免疫组化染色显示NF-κB p65在正常对照组肠黏膜上皮和固有层只有极少的弱阳性表达。但在UC组肠黏膜表面上皮、隐窝上皮细胞、固有层单个核细胞都有NF-κB p65的高表达，以胞核表达为主。
NF-κB p65在溃疡性结肠炎患者肠黏膜中的表达为30/32（93.7%）显著高于和正常对照者7/16（43.7%）（P<0.001），并且随着病变严重程度加重而增高（表2.1）。
表2.1 对照组及不同严重程度溃疡性结肠炎患者肠黏膜内NF-κB p65的阳性积分比较
注：a为P<0.001 vs 对照组；b为P<0.05 vs UCⅠ级组
2.2SIGIRR表达与溃疡性结肠炎及其严重程度的关系
免疫组化染色显示SIGIRR在正常对照组肠黏膜上皮和固有层均有中等量表达，但在UC组肠黏膜表面上皮、隐窝上皮细胞、固有层单个核细胞均为不表达或弱阳性表达
SIGIRR在溃疡性结肠炎患者肠黏膜中的表达为20/32（62.5%）显著低于正常对照者15/16（93.7%） （P<0.05），并且随着病变严重程度加重而减少（表2.2）。
表2.2 对照组及不同严重程度溃疡性结肠炎患者肠黏膜内SIGIRR的阳性积分比较
注：a为P<0.001 vs 对照组；b为P<0.05 vs UCⅠ级组
2.4溃疡性结肠炎患者肠黏膜中SIGIRR和NF-κB p65表达间的相互关系
经Spearman等级相关分析表明NF-κB p65和SIGIRR的表达呈显著负相关（P<0.05）。
3.讨论
本研究发现NF-κB p65在溃疡性结肠炎肠黏膜上皮细胞和固有层的单核细胞表达增强，呈胞浆和胞核共表达，以胞核表达为主，提示NF-κB p65处于激活状态，且NF-κB p65的表达强度随着肠黏膜炎症的加剧其表达逐渐增加。Neurath 等[6]研究发现IBD患者巨噬细胞内NF-κB活性增加，并伴随促炎细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α的显著增加，而给予NF-κB P65的反义寡核苷酸处理后，随着NF-κB P65下调，促炎因子的水平也下降。Murano等[7]研究发现用NF-κB P65的反义寡核苷酸处理小鼠，可明显改善DSS诱导的小鼠IBD的临床症状和组织学改变，同时降低肠黏膜内促炎细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α水平。这些研究进一步证实了NF-κB的活化在IBD致病中的作用。 研究發现SIGIRR与肠道炎症和免疫反应密切相关[8、 9]。Garlanda等[10 11]研究发现，SIGIRR缺乏小鼠对硫酸葡聚糖钠（Dextran sulfate sodium，DSS）诱发的肠道炎症更为敏感，其黏膜的炎症程度和局部的促炎因子和化学趋化因子水平均显著增加。Xiao等[12]研究也发现SIGIRR缺陷小鼠经DSS处理后肠上皮的炎症反应加重，局部的NF-κB活性和促炎因子（IL-12、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-1β）也显著增加。此结论在另一个实验中也得到证实，即SIGIRR缺乏更容易导致结肠息肉的形成[13]。Naito等[14]用寡核苷酸探针检测了4例克罗恩病和正常人外周血单核细胞在LPS刺激前后多种基因mRNA的表达，发现在克罗恩病患者SIGIRR表达在LSP刺激前后均低于正常人，并且在LPS刺激后显著低于刺激前。提示在克罗恩病患者外周血单核细胞中SIGIRR表达受抑制，而LSP刺激后更加剧了它的抑制。这进一步证实了SIGIRR可能参与了UC的致病。因此，SIGIRR可能是UC治疗的潜在靶点。本研究发现正常对照组肠黏膜上皮细胞及固有层炎症细胞均明显表达SIGIRR，而UC患者肠黏膜表面上皮、隐窝上皮细胞、固有层单个核细胞SIGIRR表达明显减少，显著低于正常肠黏膜，并且随着炎症的加剧其表达逐渐降低。同时SIGIRR与NF-κB p65的表达呈显著负相关（P<0.05），提示SIGIRR可能通过负性调节NF-κB p65通路进行调控，它在正常肠上皮细胞高表达，然而在UC患者肠黏膜中表达低下，这可能是UC患者NF-κB p65信号通路过度激活的机制之一。
NF-κB p65信号通路在UC的发病过程中具有重要作用，随着对其负性调控因子SIGIRR研究的深入，必将为指导治疗UC提供新的思路。
参考文献：
1、Rousseaux C， Desreumaux P. The peroxisome-proliferator-activated gamma receptor and chronic inflammatory bowel disease （PPARgamma and IBD） J Soc Biol. 2006；200（2）：121-31.
2、 龚文亮.惠迪粒对溃疡性结肠炎患者血清IL- 6、TNF- α的影响. 中国医学创新，2013，10（11）：17-18.
3、 中华医学会消化病学分会.对炎症性肠病诊断治疗规范的建议.中华消化杂志2001 21：236-239。
4、施先艳，邓长生.溃疡性结肠炎.见：邓长生，夏冰主编.炎症性肠病.北京：人民卫生出版社，1998.183～189.
5、Sasaki H， Nio M， Iwami D， Funaki N， Sano N， Ohi R， Sasano H. E-cadherin， alpha-catenin and beta-catenin in biliary atresia： correlation with apoptosis and cell cycle. Pathol Int. 2001；51（12）：923-32.
6、Neurath MF， Fuss I， Schürmann G， et al.Cytokine gene transcription by NF-kappa B family members in patients with inflammatory bowel disease. Ann N Y Acad Sci.1998；859：149-159.
7、Murano M， Maemura K， Hirata I， et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B （p65） antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium （DSS）-induced colitis. Clin Exp Immunol. 2000；120（1）：51-58.
8、 Noris M，Cassis P，Azzollini N，et al. The Toll-IL-1R member Tir8/SIGIRR negatively regulates adaptive immunity against kidney grafts[J]. J Immunol，2009，183（7）：4249.
9、 Lech M，Skuginna V，Kulkarni OP，et al.Lack of SIGIRR/TIR8 aggravates hydrocarbon oil-induced lupus nephritis[J].J Pathol，2010，
10、Garlanda C， Riva F， Polentarutti N， et al. Intestinal inflammation in mice deficient in Tir8， an inhibitory member of the IL-1 receptor family. Proc Natl Acad Sci USA. 2004；101（10）： 3522-35266.
11. Garlanda C， Riva F， Veliz T， Polentarutti N， et al. Increased susceptibility to colitis-associated cancer of mice lacking TIR8， an inhibitory member of the interleukin-1 receptor family. Cancer Res. 2008；67（13）：6017-6021
12、Xiao H， Gulen MF， Qin J， et al.The Toll-interleukin-1 receptor member SIGIRR regulates colonic epithelial homeostasis， inflammation， and tumorigenesis. Immunity. 2007；26（4）：461-475.
13、Xiao H，Yin W，Khan MA，et al. Loss of single immunoglobulin interlukin-receptor-related molecule leads to enhanced colonic polyposis in Apc（min） mice[J].Gastroenterology，2010，139（2）：574.
14、Naito Y， Takagi T， Mizushima K， et al. Gene expression clusters of a lipopolysaccharide- stimulated pathway in peripheral blood monocytes of Japanese patients with Crohn's disease. Aliment Pharmacol Ther. 2009；24 Suppl 4：256-265.