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[摘要] 目的 探讨系统性红斑狼疮（SLE）患儿外周血淋巴细胞亚群变化特征。 方法 选择24例SLE病儿和20例健康儿童为研究对象，应用流式细胞术（FCM）检测外周血的淋巴细胞亚群，对比分析两组检测结果。 结果 SLE患儿外周血CD4+CD25+T细胞、自然杀伤（NK）细胞百分率较对照组明显降低（t=2.480，3.773；P<0.05）， CD8+T细胞、活化T细胞和B 细胞百分率明显升高（t=3.470，4.779，2.480；P<0.05或P<0.01）。 结论 SLE患儿外周血淋巴细胞亚群紊乱，调节性T细胞和NK细胞减少、B细胞增多和T细胞活化增强，在SLE发病机制中可能起重要作用。
[关键词]系统性红斑狼疮；儿童；淋巴细胞亚群
[中图分类号] R593.241 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）23-57-03
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematesus，SLE）是儿童较为常见的自身免疫病之一，亚洲儿童SLE的发病率为（6.3～19.3）/10万，成人SLE患者中约15%～20%在儿童期起病[1]，儿童SLE较成人临床表现更为严重，有潜在的致命性，预后更严重。SLE为多系统、多器官受累的全身性自身免疫病，以多克隆B细胞的活化和产生多种自身抗体为特征。其发病与多因素有关，包括个体易感基因、环境因素及两者之间的相互作用等造成患儿免疫系统存在不同程度的异常和失衡[2]，其中淋巴细胞亚群比例失调或功能异常、细胞因子及其受体的基因结构、转录及功能缺陷、淋巴细胞凋亡失常等因素可能与其发病有关[3-4]。本研究通过测定SLE患儿及健康患儿外周血淋巴细胞亚群的改变，探讨淋巴细胞亚群变化与儿童SLE发病的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 SLE组 选择2010年1月～2013年6月在青岛大学医学院附属医院儿内科住院诊治的SLE患儿共24例为研究对象，均符合1997年美国风湿病学会（ARA）修订后的SLE诊断标准，男3例，女21例，男∶女=1∶7；起病年龄平均（10.6±1.9）岁。
1.1.2 正常对照组 选取20例健康体检儿童作为对照组，其中女17例，男3例；平均年龄（9.5±1.9）岁。与SLE组在年龄、性别方面比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 检测指标与方法
1.2.1 标本采集 两组儿童均清晨空腹取外周静脉血2mL，加入无菌肝素管（肝素20U/mL），充分抗凝后送检。
1.2.2 仪器与试剂 （1）主要试剂：FITC/PE标记单克隆抗体：CD3-FITC/CDl6+56-PE、CD4-FITC/CD8-PE、CD4-FITC/CD25-PE、CD19-PE、CD3-FITC/HLADR-PE；全血溶血试剂：A甲酸 B碳酸钠等 C多聚甲醛；鞘液；清洗液；荧光微球。均由美国贝克曼库尔特公司提供。（2）仪器：流式细胞仪，美国贝克曼库尔特公司生产。仪器型号： Epics-XL。
1.2.3 检测指标与方法 取100μL待测血清样品分别加入CD3-FITC/CDl6+56-PE、CD4-FITC/CD8-PE、CD19-PE、CD4-FITC/CD25-PE、CD3-FITC/HLADR-PE及FITC/
PE标记单克隆抗体各20μL，混匀，放置于室温下避光孵育15～20min后加入甲酸溶血液600μL，碳酸钠缓冲液250μL，混匀，溶血10min， PBS洗涤细胞，1500r/min离心5min，弃掉上清液，用1%的多聚甲醛0.5mL固定细胞，应用美国Beckman-Coulter公司Epics-XL型流式细胞仪测定CD3+（总T）、CD3+CD4+（辅助性T）、CD3+CD8+（细胞毒性T）、CD3+HLADR+ （活化T）及CD3-CD56+（NK细胞）、CD4+CD25+（调节性T）和CD19+（B细胞）百分率。
1.3 统计学处理
采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理。实验数据呈正态分布，以（）表示。采用t检验，以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
SLE患儿及对照组外周血淋巴细胞亚群测定结果见表1。经统计学分析发现，SLE患儿疾病活动期外周血中CD4+CD25+ T细胞和自然杀伤（NK）细胞百分率明显低于对照组，差异有统计学意义（t=2.480，3.773；P<0.05）；而CD3+CD8+ T细胞和B细胞百分率明显高于对照组（t=3.470，2.480；P<0.05），活化T（CD3+HLADR+）细胞百分率显著高于对照组，差异有统计学意义（t=4.779，P<0.01）；CD3+ T细胞和CD3+CD4+ T细胞百分率与对照组差异无统计学意义（t=0.269，0.465；P>0.05）。
3 讨论
系统性红斑狼疮患儿存在免疫系统紊乱，T、B淋巴细胞的免疫耐受丧失导致针对自身细胞抗原的抗体的持续性产生，并形成免疫复合物，激活补体系统，继而引起全身各组织系统损伤。人体正常免疫应答过程有赖于各种免疫细胞之间的相互协作和相互制约，SLE患儿外周血中出现的大量自身抗体说明了自身反应性B细胞的存在和活化，而B细胞增殖活化有赖于调节细胞的调节，淋巴细胞亚群的紊乱与SLE的发生、发展密切相关。有研究发现：SLE患儿中存在CD4T、CD4/CD8比例降低，CD8T细胞升高，并认为SLE的发病是由于CD8T细胞比率增高、功能缺陷所致的B细胞多克隆抗体产生激活及体液免疫异常导致[5]。本实验结果示：SLE患儿组与健康对照组比较CD3+T淋巴细胞没有明显变化， CD8T细胞、B细胞较健康组明显升高，CD4T细胞较健康组无差异，但活化T细胞百分率显著增高，表现为细胞免疫亢进状态。有学者认为：虽然SLE患儿外周血中CD8+T细胞以数量升高为主，但CD8细胞几乎全部为反抑制性T淋巴细胞，不能显示抑制CD4T细胞功能[6]。本例中CD4T细胞没有升高，可能与实验对象例数较少及部分患儿已应用糖皮质激素等免疫抑制剂治疗有关，活化T细胞显著升高，提示T细胞亚群的异常改变、活化在系统性红斑狼疮患者的发病中起很大作用。也有研究表明SLE患儿CD4T细胞的减少，尤其是具有抑制诱导作用的T细胞（CD4+2H4+）降低，不能诱导CD8T对B细胞产生抑制作用，因此SLE患者虽有CD4T减少，CD8T正常或稍高，但仍表现为体液免疫亢进，B细胞增殖并产生大量自身抗体[7]。 细胞凋亡对于免疫系统形成自身免疫耐受具有重要的意义，在中枢免疫器官，未成熟的淋巴细胞在接触自身抗原后自行凋亡而形成对自身的免疫耐受，避免自身免疫病的发生。外周T、B淋巴细胞在参与对抗原的应答之后，也经凋亡消除，以免产生过度应答，造成机体组织器官损伤。如果免疫细胞凋亡紊乱，自身反应性的免疫细胞未经凋亡消除， 可导致自身免疫病的发生。NK细胞可调节自身免疫反应，活化NK细胞可分泌IFN-r、TNF-a等细胞因子，抑制B细胞的分化增殖，并对T细胞介导的免疫起调节作用[8]。本研究结果显示，SLE患儿外周血中NK细胞较对照组明显降低，说明NK细胞对外周血自身反应性B细胞清除减弱，使多种自身抗体产生。刘涛的实验结果与本结果相同，且证实NK细胞治疗后较治疗前升高，认为NK细胞变化可直接反应机体存在免疫紊乱状态[9]。CD4CD25T细胞即调节性T细胞具有抑制自身免疫反应、防止病理性免疫反应发生的作用。将去除了CD4CD25细胞的CD4单阳性T细胞移植给T细胞缺陷小鼠，能导致宿主各种器官特异性自身免疫病，如1型糖尿病、肾小球肾炎、胃炎和多关节炎等；而将含有CD4CD25T细胞和CD4单阳性T细胞同时过继给实验小鼠，则能防止自身免疫病的发生。目前已在人的胸腺和外周血中发现CD4CD25T细胞，并证实其具有类似的功能特征[10-11]。CD4+CD25+T细胞可以通过细胞接触依赖或抑制性细胞因子依赖机制主动抑制自身免疫T细胞的活化，维持自身免疫耐受，防止自身免疫病的发生，其中高表达CD4+CD25highT细胞是具有免疫抑制作用的T调节细胞，转录因子Foxp3在CD4+CD25+Treg细胞的功能上发挥重要的作用。有研究结果显示，初诊SLE患者外周血CD4CD25T细胞及Foxp3水平显著低于复发、治疗后及健康对照组[12]。尤海燕的研究发现，SLE患者调节性T细胞降低，并认为可能由于调节性T细胞介导的负向调控紊乱，不能抑制Th17细胞等引起的自身免疫反应，导致机体免疫耐受失衡引发免疫损伤[13]。本研究结果也显示SLE患儿CD4+CD25+T细胞降低，提示其抑制T细胞活化增殖作用下降可能与SLE发病有关。
综上所述，SLE患儿存在CD8T细胞、CD4CD25T细胞和NK细胞数量及功能失调，不能产生抑制CD4T细胞的作用，在CD4T细胞作用下，B细胞活化持续产生自身抗体并导致组织器官损伤，其具体的发病机制还需进一步研究。SLE患儿淋巴细胞亚群存在异常，检测SLE患儿外周血淋巴细胞亚群的数量及功能变化，对进一步揭示SLE 的发病机制具有重要意义。
[参考文献]
[1] HuangJL，Yeh KW，Yao TC，et al.Pediatric lupus in Asia[J].Lupus，2010，19（12）：1414-1418.
[2] Liu Z，Davidson A.Taming lupus—a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances[J].Nature Medicine，2012，18（6）：871-882.
[3] Meera R，Wang XB，Huang WQ，et al.Similarities and differences between selective and nonselective BAFF blockade in urine SLE[J].J Clin Invest，2006，116（3）：724-734.
[4] 方爱平，任莉莉，陈德衡，等.系统性红斑狼疮患者外周T、B 淋巴细胞亚群基因表达谱研究[J].吉林医学，2010， 31（21）：3468-3470.
[5] 赵高阳.儿童系统性红斑狼疮外周血淋巴细胞亚群变化的临床意义[J].中国中西医结合儿科学，2011，3（2）： 179-180.
[6] 马红，李遇梅，李政亮，等.系统性红斑狼疮患者外周血CD4+CD8+T细胞p16基因mRNA表达[J].临床皮肤科杂志，2010，39（8）：483-485.
[7] Janko C，Schorn C，Grossmayer GE，et al.Inflammatory clearance of apoptonic remnants in systemic lupus erythematosus（SLE）[J].Autoimmun Rey，2008，8（1）：9-12.
[8] Park YW，Kee SJ，Cho YN，et al.Impaired differentiation and cytotoxicity of natural killer cells in systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum，2009，60（6）：1753-1763.
[9] 刘涛，赵令，张彦东，等.环磷酰胺对儿童系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞亚群变化的影响[J].吉林大学学报（医学版），2012，6（38）：1168-1172.
[10] Dieckmann D，Plottner H，Berchtold S，et al.Ex vivo isolation and characterization of CD4+ CD25+ T cells with regulatory properties from human blood[J].J Exp Med，2001，193（11）：1303-1310.
[11] Stephens LA，MottetC，Mason D，et al.Human CD4+CD25+ thymocytes and peripheral T cells have immune suppressive activity in vitro[J].Eur J Immuno，2001，4（31）：1247-1254.
[12] 陈建英，王玲.系统性红斑狼疮患者CD4CD25调节性T淋巴细胞临床研究[J].检验医学与临床，2012，9（8）：931-933.
[13] 尤海燕，李晶，焦志军，等.系统性红斑狼疮患者外周血Th17细胞与调节性T细胞的变化[J].中华风湿学杂志，2012，1（16）：50-52.
（收稿日期：2013-10-29）
[关键词]系统性红斑狼疮；儿童；淋巴细胞亚群
[中图分类号] R593.241 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）23-57-03
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematesus，SLE）是儿童较为常见的自身免疫病之一，亚洲儿童SLE的发病率为（6.3～19.3）/10万，成人SLE患者中约15%～20%在儿童期起病[1]，儿童SLE较成人临床表现更为严重，有潜在的致命性，预后更严重。SLE为多系统、多器官受累的全身性自身免疫病，以多克隆B细胞的活化和产生多种自身抗体为特征。其发病与多因素有关，包括个体易感基因、环境因素及两者之间的相互作用等造成患儿免疫系统存在不同程度的异常和失衡[2]，其中淋巴细胞亚群比例失调或功能异常、细胞因子及其受体的基因结构、转录及功能缺陷、淋巴细胞凋亡失常等因素可能与其发病有关[3-4]。本研究通过测定SLE患儿及健康患儿外周血淋巴细胞亚群的改变，探讨淋巴细胞亚群变化与儿童SLE发病的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 SLE组 选择2010年1月～2013年6月在青岛大学医学院附属医院儿内科住院诊治的SLE患儿共24例为研究对象，均符合1997年美国风湿病学会（ARA）修订后的SLE诊断标准，男3例，女21例，男∶女=1∶7；起病年龄平均（10.6±1.9）岁。
1.1.2 正常对照组 选取20例健康体检儿童作为对照组，其中女17例，男3例；平均年龄（9.5±1.9）岁。与SLE组在年龄、性别方面比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 检测指标与方法
1.2.1 标本采集 两组儿童均清晨空腹取外周静脉血2mL，加入无菌肝素管（肝素20U/mL），充分抗凝后送检。
1.2.2 仪器与试剂 （1）主要试剂：FITC/PE标记单克隆抗体：CD3-FITC/CDl6+56-PE、CD4-FITC/CD8-PE、CD4-FITC/CD25-PE、CD19-PE、CD3-FITC/HLADR-PE；全血溶血试剂：A甲酸 B碳酸钠等 C多聚甲醛；鞘液；清洗液；荧光微球。均由美国贝克曼库尔特公司提供。（2）仪器：流式细胞仪，美国贝克曼库尔特公司生产。仪器型号： Epics-XL。
1.2.3 检测指标与方法 取100μL待测血清样品分别加入CD3-FITC/CDl6+56-PE、CD4-FITC/CD8-PE、CD19-PE、CD4-FITC/CD25-PE、CD3-FITC/HLADR-PE及FITC/
PE标记单克隆抗体各20μL，混匀，放置于室温下避光孵育15～20min后加入甲酸溶血液600μL，碳酸钠缓冲液250μL，混匀，溶血10min， PBS洗涤细胞，1500r/min离心5min，弃掉上清液，用1%的多聚甲醛0.5mL固定细胞，应用美国Beckman-Coulter公司Epics-XL型流式细胞仪测定CD3+（总T）、CD3+CD4+（辅助性T）、CD3+CD8+（细胞毒性T）、CD3+HLADR+ （活化T）及CD3-CD56+（NK细胞）、CD4+CD25+（调节性T）和CD19+（B细胞）百分率。
1.3 统计学处理
采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理。实验数据呈正态分布，以（）表示。采用t检验，以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
SLE患儿及对照组外周血淋巴细胞亚群测定结果见表1。经统计学分析发现，SLE患儿疾病活动期外周血中CD4+CD25+ T细胞和自然杀伤（NK）细胞百分率明显低于对照组，差异有统计学意义（t=2.480，3.773；P<0.05）；而CD3+CD8+ T细胞和B细胞百分率明显高于对照组（t=3.470，2.480；P<0.05），活化T（CD3+HLADR+）细胞百分率显著高于对照组，差异有统计学意义（t=4.779，P<0.01）；CD3+ T细胞和CD3+CD4+ T细胞百分率与对照组差异无统计学意义（t=0.269，0.465；P>0.05）。
3 讨论
系统性红斑狼疮患儿存在免疫系统紊乱，T、B淋巴细胞的免疫耐受丧失导致针对自身细胞抗原的抗体的持续性产生，并形成免疫复合物，激活补体系统，继而引起全身各组织系统损伤。人体正常免疫应答过程有赖于各种免疫细胞之间的相互协作和相互制约，SLE患儿外周血中出现的大量自身抗体说明了自身反应性B细胞的存在和活化，而B细胞增殖活化有赖于调节细胞的调节，淋巴细胞亚群的紊乱与SLE的发生、发展密切相关。有研究发现：SLE患儿中存在CD4T、CD4/CD8比例降低，CD8T细胞升高，并认为SLE的发病是由于CD8T细胞比率增高、功能缺陷所致的B细胞多克隆抗体产生激活及体液免疫异常导致[5]。本实验结果示：SLE患儿组与健康对照组比较CD3+T淋巴细胞没有明显变化， CD8T细胞、B细胞较健康组明显升高，CD4T细胞较健康组无差异，但活化T细胞百分率显著增高，表现为细胞免疫亢进状态。有学者认为：虽然SLE患儿外周血中CD8+T细胞以数量升高为主，但CD8细胞几乎全部为反抑制性T淋巴细胞，不能显示抑制CD4T细胞功能[6]。本例中CD4T细胞没有升高，可能与实验对象例数较少及部分患儿已应用糖皮质激素等免疫抑制剂治疗有关，活化T细胞显著升高，提示T细胞亚群的异常改变、活化在系统性红斑狼疮患者的发病中起很大作用。也有研究表明SLE患儿CD4T细胞的减少，尤其是具有抑制诱导作用的T细胞（CD4+2H4+）降低，不能诱导CD8T对B细胞产生抑制作用，因此SLE患者虽有CD4T减少，CD8T正常或稍高，但仍表现为体液免疫亢进，B细胞增殖并产生大量自身抗体[7]。 细胞凋亡对于免疫系统形成自身免疫耐受具有重要的意义，在中枢免疫器官，未成熟的淋巴细胞在接触自身抗原后自行凋亡而形成对自身的免疫耐受，避免自身免疫病的发生。外周T、B淋巴细胞在参与对抗原的应答之后，也经凋亡消除，以免产生过度应答，造成机体组织器官损伤。如果免疫细胞凋亡紊乱，自身反应性的免疫细胞未经凋亡消除， 可导致自身免疫病的发生。NK细胞可调节自身免疫反应，活化NK细胞可分泌IFN-r、TNF-a等细胞因子，抑制B细胞的分化增殖，并对T细胞介导的免疫起调节作用[8]。本研究结果显示，SLE患儿外周血中NK细胞较对照组明显降低，说明NK细胞对外周血自身反应性B细胞清除减弱，使多种自身抗体产生。刘涛的实验结果与本结果相同，且证实NK细胞治疗后较治疗前升高，认为NK细胞变化可直接反应机体存在免疫紊乱状态[9]。CD4CD25T细胞即调节性T细胞具有抑制自身免疫反应、防止病理性免疫反应发生的作用。将去除了CD4CD25细胞的CD4单阳性T细胞移植给T细胞缺陷小鼠，能导致宿主各种器官特异性自身免疫病，如1型糖尿病、肾小球肾炎、胃炎和多关节炎等；而将含有CD4CD25T细胞和CD4单阳性T细胞同时过继给实验小鼠，则能防止自身免疫病的发生。目前已在人的胸腺和外周血中发现CD4CD25T细胞，并证实其具有类似的功能特征[10-11]。CD4+CD25+T细胞可以通过细胞接触依赖或抑制性细胞因子依赖机制主动抑制自身免疫T细胞的活化，维持自身免疫耐受，防止自身免疫病的发生，其中高表达CD4+CD25highT细胞是具有免疫抑制作用的T调节细胞，转录因子Foxp3在CD4+CD25+Treg细胞的功能上发挥重要的作用。有研究结果显示，初诊SLE患者外周血CD4CD25T细胞及Foxp3水平显著低于复发、治疗后及健康对照组[12]。尤海燕的研究发现，SLE患者调节性T细胞降低，并认为可能由于调节性T细胞介导的负向调控紊乱，不能抑制Th17细胞等引起的自身免疫反应，导致机体免疫耐受失衡引发免疫损伤[13]。本研究结果也显示SLE患儿CD4+CD25+T细胞降低，提示其抑制T细胞活化增殖作用下降可能与SLE发病有关。
综上所述，SLE患儿存在CD8T细胞、CD4CD25T细胞和NK细胞数量及功能失调，不能产生抑制CD4T细胞的作用，在CD4T细胞作用下，B细胞活化持续产生自身抗体并导致组织器官损伤，其具体的发病机制还需进一步研究。SLE患儿淋巴细胞亚群存在异常，检测SLE患儿外周血淋巴细胞亚群的数量及功能变化，对进一步揭示SLE 的发病机制具有重要意义。
[参考文献]
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[2] Liu Z，Davidson A.Taming lupus—a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances[J].Nature Medicine，2012，18（6）：871-882.
[3] Meera R，Wang XB，Huang WQ，et al.Similarities and differences between selective and nonselective BAFF blockade in urine SLE[J].J Clin Invest，2006，116（3）：724-734.
[4] 方爱平，任莉莉，陈德衡，等.系统性红斑狼疮患者外周T、B 淋巴细胞亚群基因表达谱研究[J].吉林医学，2010， 31（21）：3468-3470.
[5] 赵高阳.儿童系统性红斑狼疮外周血淋巴细胞亚群变化的临床意义[J].中国中西医结合儿科学，2011，3（2）： 179-180.
[6] 马红，李遇梅，李政亮，等.系统性红斑狼疮患者外周血CD4+CD8+T细胞p16基因mRNA表达[J].临床皮肤科杂志，2010，39（8）：483-485.
[7] Janko C，Schorn C，Grossmayer GE，et al.Inflammatory clearance of apoptonic remnants in systemic lupus erythematosus（SLE）[J].Autoimmun Rey，2008，8（1）：9-12.
[8] Park YW，Kee SJ，Cho YN，et al.Impaired differentiation and cytotoxicity of natural killer cells in systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum，2009，60（6）：1753-1763.
[9] 刘涛，赵令，张彦东，等.环磷酰胺对儿童系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞亚群变化的影响[J].吉林大学学报（医学版），2012，6（38）：1168-1172.
[10] Dieckmann D，Plottner H，Berchtold S，et al.Ex vivo isolation and characterization of CD4+ CD25+ T cells with regulatory properties from human blood[J].J Exp Med，2001，193（11）：1303-1310.
[11] Stephens LA，MottetC，Mason D，et al.Human CD4+CD25+ thymocytes and peripheral T cells have immune suppressive activity in vitro[J].Eur J Immuno，2001，4（31）：1247-1254.
[12] 陈建英，王玲.系统性红斑狼疮患者CD4CD25调节性T淋巴细胞临床研究[J].检验医学与临床，2012，9（8）：931-933.
[13] 尤海燕，李晶，焦志军，等.系统性红斑狼疮患者外周血Th17细胞与调节性T细胞的变化[J].中华风湿学杂志，2012，1（16）：50-52.
（收稿日期：2013-10-29）