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摘要[目的]筛选对石榴枯萎病菌具有拮抗作用的内生生防菌。[方法]从采自云南蒙自的石榴叶片中分离并获得5株内生拮抗菌，通过测定其对甘薯长喙壳（Ceratocystis fimbriata）的抑菌能力筛选出1株具有高效拮抗作用的生防菌株Y2，对其进行抑菌谱测定及鉴定。[结果]经生理生化和16S rDNA序列测定表明Y2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。[结论]试验结果为石榴枯萎病的防治提供了理论依据。
关键词石榴；内生菌；拮抗作用；分离与鉴定
中图分类号S436.6文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-125-02
石榴作为一种新兴高档水果，近年来在我国发展较快。云南省蒙自县石榴连片种植面积达0.63万hm2，居全國前列。石榴枯萎病是我国一种新的果树病害。病害初期症状表现为少数枝条上叶片发黄萎蔫，随后根部和树主干木质部变褐，并且其横切面木质部呈现放射状黑褐色坏死，多数石榴树在21～28 d内全株发病死亡，生长10年以上石榴树的发病率（6.0%）高于生长 1～5 年的石榴树（1.0%）。该病害由子囊菌亚门长喙壳科长喙壳属的甘薯长喙壳（Ceratocystis fimbriata）引起，被当地果农称为石榴的“癌症”。该病害自1999年零星发生后逐年加重，造成石榴产业的毁灭性损失。
目前石榴枯萎病在国内仅云南省有发现，研究者对该病害的研究报道较少，黄琼等于 2003 年首次报道了石榴枯萎病害在我国的发生。笔者从石榴中分离并鉴定了对石榴枯萎病菌有拮抗作用的内生生防菌，以期为石榴枯萎病的防治提供参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试植物。试验材料为取自云南省蒙自市甲村的石榴叶。
1.1.2供试菌株。
以甘薯长喙壳作为供试病原菌。水稻稻瘟菌（Magnaporthe grisea）、玉米弯孢弯霉叶斑病菌（Curvularia lunata）、康乃馨枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.Dianthi）、石榴枯萎病菌（Ceratocystis fimbriata）、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis）、苹果斑点病菌（Alternaria alternate f.sp.Mali）、烟草赤星病菌（Alternaria alternate）、魔芋基腐病菌（Alternaia）、三七根腐病菌（Fusarium solani）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、甘蔗黑腐病菌（Ceratocystis adiposum）11种供试病原菌均由玉溪师范学院分子生物学实验室提供。
1.2方法
1.2.1石榴内生菌的分离。参照高玲玲等的方法对石榴叶进行石榴内生菌的分离。
1.2.2具有抑制作用的细菌筛选。
以甘薯长喙壳作为供试病原菌，采用抑菌圈法及平板对峙方法筛选具有抑制作用的细菌，并计算其生长抑制率。
抑制率=（dCK-dB）/dCK×100%
式中，dCK表示对照病原菌菌落直径；dB表示处理病原菌菌落直径。
1.2.3拮抗菌株抑菌谱测定。
以水稻稻瘟菌、玉米弯孢弯霉叶斑病菌、康乃馨枯萎病菌、石榴枯萎病菌、小麦全蚀病菌、苹果斑点病菌、烟草赤星病菌、魔芋基腐病菌、三七根腐病菌、番茄灰霉病菌、甘蔗黑腐病菌为供试病原菌。采用对峙培养法，以不接种目的细菌作为对照，于25 ℃下恒温培养，5 d后测定病原菌的菌落直径，计算其生长抑制率。
1.2.4菌株的鉴定。
1.2.4.1生理生化试验。参照文献[4]对菌株进行生理生化特征试验。
1.2.4.216S rDNA基因片段序列测定。参照Weisburg等的方法扩增细菌的16S rDNA片段。采用细菌通用引物27F（5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3′）和1525R（5′AAGGAGGTGWTCCARCC3′），预期扩增片段大小为1 500 bp。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后回收、纯化、测序。
2结果与分析
2.1石榴内生菌的分离结果
将表面消毒后的石榴叶片研磨，悬液涂布在LB培养基上，分离得到23株石榴内生菌。
2.2抑制细菌的筛选及其抑制作用的检测结果
为确定分离得到的23株内生细菌对石榴枯萎病菌的抑菌效果，利用甘薯长喙壳进行抑菌测定，结果表明其中5株内生菌具有抑菌作用，其抑制率都在50%以上，分别命名为Y1、Y2、Y3、Y4和Y5。其中，Y2菌株对甘薯长喙壳病菌抑制作用最强，抑制率为82.4%（表1）。
2.3Y2菌株抑菌谱的测定结果
通过对11个真菌菌株的抑制作用来看（表2），菌株Y2对病原菌具有一定的抑制作用，它不仅对重大气传病害水稻稻瘟病菌有很好的抑制作用，而且对番茄枯萎病菌、小麦全蚀病菌、石榴枯萎病菌也有很好的抑制作用。这些病原菌包括半知菌亚门的镰刀菌属（Fusarium）、子囊菌亚门的长喙壳属（Ceratocystis）以及半知菌亚门的葡萄孢属（Botrytis）。
2.4Y2菌株的鉴定
2.4.1生理生化鉴定结果。
对抑菌效果最好的菌株Y2进行生理生化测定，结果表明菌株Y2各项指标均为阳性（表3）。
2.4.216S rDNA基因片段序列测定结果。利用16S rDNA基因片段序列测定，测定结果在GenBank数据库中进行Blast比较，并构建系统发育树。结果表明，菌株Y2与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（AB201120.1）有99%的相似性（图1）。结合生理生化鉴定和16S rDNA测定结果可知，菌株Y2属于枯草芽孢杆菌。 3结论与讨论
石榴枯萎病是我国一种新的植物病害，其病原菌甘薯长喙壳是导致农作物发生病害的重要病原菌。与其他研究不同，毛忠顺等研究了 26 种化学杀菌剂对石榴枯萎病菌的抑制作用。汤东生等报道大蒜根系分泌物及紫茎泽兰提取物对甘薯长喙壳及土壤中枯草芽孢杆菌的影响。该研究从石榴叶片中分离内生菌对该病害进行防治，因为内生细菌存在于植物体内，生存环境稳定，不易受到外界环境的影响，在生物防治病害中比叶际、根际的细菌具有更大的潜力。该研究首次从石榴叶中分离到具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌，具有很好的开发应用前景。
参考文献
[1] 罗雁，倪忠泽，龚秀萍，等.蒙自石榴产业现状及发展对策[J].中国果业信息，2006（1）：5-9.
[2] 黄琼，卢文洁，范金祥，等.云南发现石榴枯萎病[J].植物病理学报，2004（1）：95-96.
[3] 高玲玲，陈小龙，蒋涛，等.具有拮抗作用的水稻内生固氮菌的分离与鉴定[J].华中农业大学学报，2012，5（10）：553-557.
[4] 方中达.植病研究方法[M].3版.北京：中国农业出版社，2004.
[5] WEISBURG W G，BARNS S M，PELLETIER D A，et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogentic study[J].Journal of Bacteriology，1991，173：697-703.
[6] 毛忠顺，黄琼，王云月，等.化學杀菌剂对石榴枯萎病菌的室内抑制作用[J].吉林农业大学学报，2005，27（2）：137-139，143.
[7] 汤东生，王斌，毛忠顺，等.大蒜根系分泌物对石榴枯萎病菌和枯草芽孢杆菌的作用[J].安徽农业科学，2011，39（9）：5294-5296.
[8] 汤东生，王斌，毛忠顺，等.石榴园常用除草剂和杀菌剂对石榴枯萎病菌和枯草芽孢杆菌生长的影响[J].江苏农业科学，2011（5）：154-156.
[9] 汤东生，王斌，李成云.紫茎泽兰对石榴枯萎病菌和枯草芽孢杆菌生长的影响[J].杂草科学，2011，29（4）：224-227.
关键词石榴；内生菌；拮抗作用；分离与鉴定
中图分类号S436.6文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-125-02
石榴作为一种新兴高档水果，近年来在我国发展较快。云南省蒙自县石榴连片种植面积达0.63万hm2，居全國前列。石榴枯萎病是我国一种新的果树病害。病害初期症状表现为少数枝条上叶片发黄萎蔫，随后根部和树主干木质部变褐，并且其横切面木质部呈现放射状黑褐色坏死，多数石榴树在21～28 d内全株发病死亡，生长10年以上石榴树的发病率（6.0%）高于生长 1～5 年的石榴树（1.0%）。该病害由子囊菌亚门长喙壳科长喙壳属的甘薯长喙壳（Ceratocystis fimbriata）引起，被当地果农称为石榴的“癌症”。该病害自1999年零星发生后逐年加重，造成石榴产业的毁灭性损失。
目前石榴枯萎病在国内仅云南省有发现，研究者对该病害的研究报道较少，黄琼等于 2003 年首次报道了石榴枯萎病害在我国的发生。笔者从石榴中分离并鉴定了对石榴枯萎病菌有拮抗作用的内生生防菌，以期为石榴枯萎病的防治提供参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试植物。试验材料为取自云南省蒙自市甲村的石榴叶。
1.1.2供试菌株。
以甘薯长喙壳作为供试病原菌。水稻稻瘟菌（Magnaporthe grisea）、玉米弯孢弯霉叶斑病菌（Curvularia lunata）、康乃馨枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.Dianthi）、石榴枯萎病菌（Ceratocystis fimbriata）、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis）、苹果斑点病菌（Alternaria alternate f.sp.Mali）、烟草赤星病菌（Alternaria alternate）、魔芋基腐病菌（Alternaia）、三七根腐病菌（Fusarium solani）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、甘蔗黑腐病菌（Ceratocystis adiposum）11种供试病原菌均由玉溪师范学院分子生物学实验室提供。
1.2方法
1.2.1石榴内生菌的分离。参照高玲玲等的方法对石榴叶进行石榴内生菌的分离。
1.2.2具有抑制作用的细菌筛选。
以甘薯长喙壳作为供试病原菌，采用抑菌圈法及平板对峙方法筛选具有抑制作用的细菌，并计算其生长抑制率。
抑制率=（dCK-dB）/dCK×100%
式中，dCK表示对照病原菌菌落直径；dB表示处理病原菌菌落直径。
1.2.3拮抗菌株抑菌谱测定。
以水稻稻瘟菌、玉米弯孢弯霉叶斑病菌、康乃馨枯萎病菌、石榴枯萎病菌、小麦全蚀病菌、苹果斑点病菌、烟草赤星病菌、魔芋基腐病菌、三七根腐病菌、番茄灰霉病菌、甘蔗黑腐病菌为供试病原菌。采用对峙培养法，以不接种目的细菌作为对照，于25 ℃下恒温培养，5 d后测定病原菌的菌落直径，计算其生长抑制率。
1.2.4菌株的鉴定。
1.2.4.1生理生化试验。参照文献[4]对菌株进行生理生化特征试验。
1.2.4.216S rDNA基因片段序列测定。参照Weisburg等的方法扩增细菌的16S rDNA片段。采用细菌通用引物27F（5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3′）和1525R（5′AAGGAGGTGWTCCARCC3′），预期扩增片段大小为1 500 bp。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后回收、纯化、测序。
2结果与分析
2.1石榴内生菌的分离结果
将表面消毒后的石榴叶片研磨，悬液涂布在LB培养基上，分离得到23株石榴内生菌。
2.2抑制细菌的筛选及其抑制作用的检测结果
为确定分离得到的23株内生细菌对石榴枯萎病菌的抑菌效果，利用甘薯长喙壳进行抑菌测定，结果表明其中5株内生菌具有抑菌作用，其抑制率都在50%以上，分别命名为Y1、Y2、Y3、Y4和Y5。其中，Y2菌株对甘薯长喙壳病菌抑制作用最强，抑制率为82.4%（表1）。
2.3Y2菌株抑菌谱的测定结果
通过对11个真菌菌株的抑制作用来看（表2），菌株Y2对病原菌具有一定的抑制作用，它不仅对重大气传病害水稻稻瘟病菌有很好的抑制作用，而且对番茄枯萎病菌、小麦全蚀病菌、石榴枯萎病菌也有很好的抑制作用。这些病原菌包括半知菌亚门的镰刀菌属（Fusarium）、子囊菌亚门的长喙壳属（Ceratocystis）以及半知菌亚门的葡萄孢属（Botrytis）。
2.4Y2菌株的鉴定
2.4.1生理生化鉴定结果。
对抑菌效果最好的菌株Y2进行生理生化测定，结果表明菌株Y2各项指标均为阳性（表3）。
2.4.216S rDNA基因片段序列测定结果。利用16S rDNA基因片段序列测定，测定结果在GenBank数据库中进行Blast比较，并构建系统发育树。结果表明，菌株Y2与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（AB201120.1）有99%的相似性（图1）。结合生理生化鉴定和16S rDNA测定结果可知，菌株Y2属于枯草芽孢杆菌。 3结论与讨论
石榴枯萎病是我国一种新的植物病害，其病原菌甘薯长喙壳是导致农作物发生病害的重要病原菌。与其他研究不同，毛忠顺等研究了 26 种化学杀菌剂对石榴枯萎病菌的抑制作用。汤东生等报道大蒜根系分泌物及紫茎泽兰提取物对甘薯长喙壳及土壤中枯草芽孢杆菌的影响。该研究从石榴叶片中分离内生菌对该病害进行防治，因为内生细菌存在于植物体内，生存环境稳定，不易受到外界环境的影响，在生物防治病害中比叶际、根际的细菌具有更大的潜力。该研究首次从石榴叶中分离到具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌，具有很好的开发应用前景。
参考文献
[1] 罗雁，倪忠泽，龚秀萍，等.蒙自石榴产业现状及发展对策[J].中国果业信息，2006（1）：5-9.
[2] 黄琼，卢文洁，范金祥，等.云南发现石榴枯萎病[J].植物病理学报，2004（1）：95-96.
[3] 高玲玲，陈小龙，蒋涛，等.具有拮抗作用的水稻内生固氮菌的分离与鉴定[J].华中农业大学学报，2012，5（10）：553-557.
[4] 方中达.植病研究方法[M].3版.北京：中国农业出版社，2004.
[5] WEISBURG W G，BARNS S M，PELLETIER D A，et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogentic study[J].Journal of Bacteriology，1991，173：697-703.
[6] 毛忠顺，黄琼，王云月，等.化學杀菌剂对石榴枯萎病菌的室内抑制作用[J].吉林农业大学学报，2005，27（2）：137-139，143.
[7] 汤东生，王斌，毛忠顺，等.大蒜根系分泌物对石榴枯萎病菌和枯草芽孢杆菌的作用[J].安徽农业科学，2011，39（9）：5294-5296.
[8] 汤东生，王斌，毛忠顺，等.石榴园常用除草剂和杀菌剂对石榴枯萎病菌和枯草芽孢杆菌生长的影响[J].江苏农业科学，2011（5）：154-156.
[9] 汤东生，王斌，李成云.紫茎泽兰对石榴枯萎病菌和枯草芽孢杆菌生长的影响[J].杂草科学，2011，29（4）：224-227.