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摘要：目的 研究幽门螺杆菌幽门螺杆菌肿瘤坏死因子α诱导蛋白（Tipα）蛋白诱导人巨噬细胞产生白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的分子机制。方法 体外克隆表达Tipα，作用于PMA处理后的THP-1细胞，ELISA检测IL-1β和IL-6的分泌情况，Western blot分析p38磷酸化变化。并用p38抑制剂SB203580处理巨噬细胞，观察Tipα对IL-1β和IL-6分泌的影响。结果 不同浓度Tipα处理巨噬细胞后，IL-1β和IL-6含量显著高于对照组。同时，Tipα也能增强巨噬细胞中p38磷酸化水平。巨噬细胞经20μmol/L SB203580处理后，IL-1β和IL-6分泌水平显著降低。结论 Tipα蛋白可能通过p38诱导巨噬细胞分泌IL-1β和IL-6
关键词：幽门螺杆菌；肿瘤坏死因子α诱导蛋白；白细胞介素-6；白细胞介素-1β
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是B型胃炎、胃和十二指肠溃疡以及胃癌的主要致病因素，全球感染率高达50%[1]。Hp致病的多样性与其尿素酶，Vac等毒力蛋白密切相关[2]。肿瘤坏死因子α诱导蛋白（tumor necrosis factor-αinducing protein，Tip-α）是最近在Hp中发现的能够诱导肿瘤坏死因子大量表达的毒力蛋白[3]。它可通过NF-κB途径引起IL-8、TNF-α和IL-1β等细胞因子分泌，从而可能是Hp发挥致炎作用的重要物质[4]。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，活化的巨噬细胞分泌的TNF-α和IL-1β等细胞因子在机体的免疫防御中起重要功能，同时在炎症反应和组织器官坏死中起毒性作用[5]。为明确Tip-α蛋白对巨噬细胞功能的影响，本研究拟观察重组Tip-α蛋白对人巨噬细胞细胞因子表达的影响，为明确Tip-α蛋白的致病机制提供实验证据。
1 材料与方法
1.1 主要实验试剂
H.pylori 26695菌株由本实验保存；大肠杆菌Top10、大肠杆菌BL21（DE3）和表达载体pET28a来自Novagen；细菌DNA提取试剂盒、ExTaq酶、小量质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ和T4 DNA连接酶G购自大连宝生物；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；IL-1β和IL-6 ELISA检测试剂盒购自Ni2+亲和层析柱购自美国GE公司，其他化学试剂购自上海生物工程有限公司。
1.2 H.pylori Tipα基因的扩增、表达载体的构建与鉴定
取在微需氧培养5天生长良好的H.pylori提取基因组DNA。在GeneBank中查得Tipα基因，设计引物后以H.pylori DNA为模板，PCR扩增Tipα基因；将pET28a载体和回收的Tipα片段各自用NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切。胶回收酶切产物。将回收的pET28a和Tipα在T4 DNA连接酶作用下16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌Top10，涂布于含Kana的LB琼脂平板，37 ℃培养16 h。
1.3 重组蛋白的表达与纯化
将构建成功的表达载体pET28a-Tipα转化大肠杆菌BL21（DE3）得到重组菌BL/pET28a-Tipα。将BL/pET28a-Tipα接种于LB培养基中诱导蛋白表达。，离心收集菌体，PBS重悬，冰浴超声破碎至澄清，12 000 r/min离心10 min，收集上清并经0.45 μM滤膜过滤，上样于Ni2+亲和层析柱，用洗涤缓冲液（50 mmol/L NaH2PO4，0.3 mol/L NaCl，40 mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗柱，除去非特异结合蛋白，用洗脱缓冲液（50 mmol/LNaH2PO4，0.3 mol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗脱，收集目的蛋白，用SDS-PAGE检测纯化结果。
1.4 Western blot检测p38磷酸化
根据试剂盒提供的步骤提细胞总蛋白并测定其浓度。获取100μg蛋白用于SDS-PAGE。分离的总蛋白或核蛋白随后转印至PVDF膜上（Millipore），并利用含5%脱脂牛奶的TBST封闭1 h，随后加入一抗抗体4 ℃孵育过夜。多次洗涤之后，加入HRP标记的二抗孵育膜1h。ECL法（Amersham）发光、显影。
1.5 ELISA检测IL-1β和IL-6分泌
100μL细胞上清液加入到每个捕获抗体包被的微孔板中，室温孵育2h。洗板后，加入100μL检测抗体，室温继续孵育2h。随后弃混合物，每孔加入100μL streptavidin-HRP，室温避光孵育20min。最后，每孔加入100μL底物，室温避光孵育20min，然后加入50μL终止液，分光光度计检测450nm处OD值。
1.6 统计学分析
应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据用均数±标准差表示，并采用单因素方差分析数据，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1 Tipα蛋白的表达与纯化
重组工程菌大肠杆菌BL21/pET28a-Tipα经超声破碎后，收集菌体沉淀和上清，经SDS-PAGE检测，在25 kD处有明显条带，而对照组没有检测到该大小条带，与预测结果相符合（图1）。用镍离子柱和透析纯化后的Tipα蛋白经SDS-PAGE检测，从图4中可以看出，蛋白纯度较高，产物表达量通过Bradford法测定，重组工程菌诱导培养4 h后，Tipα蛋白的表达量达到12 mg/L。
1：蛋白Marker；2：转pET28a的对照菌的上清蛋白；3：含pET28a-Tipα质粒的BL21（DE3）细菌经IPTG诱导后的上清蛋白 4.经镍离子亲和层析后得到的Tipα蛋白 2.2 Tipα诱导巨噬细胞p38磷酸化
采用50μg/ml Tipα与巨噬细胞孵育后，5min即可检测出明显的p38磷酸化，15分钟后达到峰值。而细胞内总p38含量无明显变化（图2）。
2.3 Tipα诱导巨噬细胞分泌IL-1β和IL-6
巨噬细胞经Tipα作用12h后，上清中IL-1β和IL-6水平显著增高。同时给予20μmol/L SB203580处理后，与50μg/ml Tipα处理组相比，IL-1β和IL-6含量显著降低。见表1。
3 讨论
Hp发挥致病作用的主要毒力因子包括菌毛、鞭毛、尿素酶、黏液酶、脂酶、磷脂酶A、溶血素、脂多糖等。其中cagA和VacA是主要的毒力因子。然而，几乎全部临床菌株都具有cagA和VacA，但大多感染人群并不表现临床症状。同时，在Hp感染的消化性溃疡及胃癌患者中有一部分菌株往往cagA和VacA呈阴性表达。因此可以推测，除了上述毒力蛋白外，Hp可能还具有其他功能未知的蛋白参与了胃粘膜损伤[3，4]。Tipα基因位于菌株的Hp0596开放读码框，编码相对分子质量为38kd的蛋白，二聚体为其活性形式，在多种临床菌株中均可检测到Tipα蛋白表达。本实验通过构建重组质粒，体外克隆表达Tipα刺激巨噬细胞的方法，结果发现蛋白处理后，细胞致炎因子IL-1β和IL-6的表达增加，提示Tip仅可能通过诱导细胞致炎因子的高表达。在炎症长期存在下，可能引起细胞增殖与凋亡的异常，原癌基因与抑癌基因表达改变，最终参与胃癌的发生。为了进一步明确Tipα诱导IL-1β和IL-6产生的分子机制，我们采用Western blot检测了p38的磷酸化情况。结果显示，Tipα处理巨噬细胞5min后即可检测出明显的磷酸化p38，高峰在10～20min。而同时采用SB203580处理细胞，抑制p38通路后，IL-1β和IL-6分泌水平显著降低，这表明p38可能参与IL-1β和IL-6的分泌。总之，胃癌的发生是一个多因素、多步骤的复杂过程。Hp感染是诱发胃癌重要的危险因子，其发病机制尚不完全清楚。Tipα做为一种新的幽门螺杆菌毒素蛋白，在Hp致胃癌的发生中可能发挥重要的作用，但其具体作用机制尚待进一步研究。
参考文献：
[1]Correa P，Fox J，Fontham E，et al.Helicobacter pylori and gastric carcinoma.Serum antibody prevalence in population with contrasting cancer [J].risks J Cancer，1990，66（12）：2569-2574
[2]Go MF，Crowe SE.Virulence and pathogenicity of Helicobacter pylori[J].Gastroenterol
Clin North Am，2000，29（3）：649-670
[3]Suganuma M，Kurusu M，Suzuki K，et al.New tumor necrosis factor-a-inducing protein released from Helicobacter pylori for gastric cancer progression[J].J Cancer Res Clin Oncol，2005，131（5）：305-313
[4]程平，施瑞华，张红杰，等.幽门螺杆菌毒素蛋白Tipα对人胃黏膜上皮细胞株GES-1 的影响[J].中华医学杂志，2008，88（22）：1528-1532
关键词：幽门螺杆菌；肿瘤坏死因子α诱导蛋白；白细胞介素-6；白细胞介素-1β
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是B型胃炎、胃和十二指肠溃疡以及胃癌的主要致病因素，全球感染率高达50%[1]。Hp致病的多样性与其尿素酶，Vac等毒力蛋白密切相关[2]。肿瘤坏死因子α诱导蛋白（tumor necrosis factor-αinducing protein，Tip-α）是最近在Hp中发现的能够诱导肿瘤坏死因子大量表达的毒力蛋白[3]。它可通过NF-κB途径引起IL-8、TNF-α和IL-1β等细胞因子分泌，从而可能是Hp发挥致炎作用的重要物质[4]。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，活化的巨噬细胞分泌的TNF-α和IL-1β等细胞因子在机体的免疫防御中起重要功能，同时在炎症反应和组织器官坏死中起毒性作用[5]。为明确Tip-α蛋白对巨噬细胞功能的影响，本研究拟观察重组Tip-α蛋白对人巨噬细胞细胞因子表达的影响，为明确Tip-α蛋白的致病机制提供实验证据。
1 材料与方法
1.1 主要实验试剂
H.pylori 26695菌株由本实验保存；大肠杆菌Top10、大肠杆菌BL21（DE3）和表达载体pET28a来自Novagen；细菌DNA提取试剂盒、ExTaq酶、小量质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ和T4 DNA连接酶G购自大连宝生物；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；IL-1β和IL-6 ELISA检测试剂盒购自Ni2+亲和层析柱购自美国GE公司，其他化学试剂购自上海生物工程有限公司。
1.2 H.pylori Tipα基因的扩增、表达载体的构建与鉴定
取在微需氧培养5天生长良好的H.pylori提取基因组DNA。在GeneBank中查得Tipα基因，设计引物后以H.pylori DNA为模板，PCR扩增Tipα基因；将pET28a载体和回收的Tipα片段各自用NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切。胶回收酶切产物。将回收的pET28a和Tipα在T4 DNA连接酶作用下16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌Top10，涂布于含Kana的LB琼脂平板，37 ℃培养16 h。
1.3 重组蛋白的表达与纯化
将构建成功的表达载体pET28a-Tipα转化大肠杆菌BL21（DE3）得到重组菌BL/pET28a-Tipα。将BL/pET28a-Tipα接种于LB培养基中诱导蛋白表达。，离心收集菌体，PBS重悬，冰浴超声破碎至澄清，12 000 r/min离心10 min，收集上清并经0.45 μM滤膜过滤，上样于Ni2+亲和层析柱，用洗涤缓冲液（50 mmol/L NaH2PO4，0.3 mol/L NaCl，40 mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗柱，除去非特异结合蛋白，用洗脱缓冲液（50 mmol/LNaH2PO4，0.3 mol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗脱，收集目的蛋白，用SDS-PAGE检测纯化结果。
1.4 Western blot检测p38磷酸化
根据试剂盒提供的步骤提细胞总蛋白并测定其浓度。获取100μg蛋白用于SDS-PAGE。分离的总蛋白或核蛋白随后转印至PVDF膜上（Millipore），并利用含5%脱脂牛奶的TBST封闭1 h，随后加入一抗抗体4 ℃孵育过夜。多次洗涤之后，加入HRP标记的二抗孵育膜1h。ECL法（Amersham）发光、显影。
1.5 ELISA检测IL-1β和IL-6分泌
100μL细胞上清液加入到每个捕获抗体包被的微孔板中，室温孵育2h。洗板后，加入100μL检测抗体，室温继续孵育2h。随后弃混合物，每孔加入100μL streptavidin-HRP，室温避光孵育20min。最后，每孔加入100μL底物，室温避光孵育20min，然后加入50μL终止液，分光光度计检测450nm处OD值。
1.6 统计学分析
应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据用均数±标准差表示，并采用单因素方差分析数据，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1 Tipα蛋白的表达与纯化
重组工程菌大肠杆菌BL21/pET28a-Tipα经超声破碎后，收集菌体沉淀和上清，经SDS-PAGE检测，在25 kD处有明显条带，而对照组没有检测到该大小条带，与预测结果相符合（图1）。用镍离子柱和透析纯化后的Tipα蛋白经SDS-PAGE检测，从图4中可以看出，蛋白纯度较高，产物表达量通过Bradford法测定，重组工程菌诱导培养4 h后，Tipα蛋白的表达量达到12 mg/L。
1：蛋白Marker；2：转pET28a的对照菌的上清蛋白；3：含pET28a-Tipα质粒的BL21（DE3）细菌经IPTG诱导后的上清蛋白 4.经镍离子亲和层析后得到的Tipα蛋白 2.2 Tipα诱导巨噬细胞p38磷酸化
采用50μg/ml Tipα与巨噬细胞孵育后，5min即可检测出明显的p38磷酸化，15分钟后达到峰值。而细胞内总p38含量无明显变化（图2）。
2.3 Tipα诱导巨噬细胞分泌IL-1β和IL-6
巨噬细胞经Tipα作用12h后，上清中IL-1β和IL-6水平显著增高。同时给予20μmol/L SB203580处理后，与50μg/ml Tipα处理组相比，IL-1β和IL-6含量显著降低。见表1。
3 讨论
Hp发挥致病作用的主要毒力因子包括菌毛、鞭毛、尿素酶、黏液酶、脂酶、磷脂酶A、溶血素、脂多糖等。其中cagA和VacA是主要的毒力因子。然而，几乎全部临床菌株都具有cagA和VacA，但大多感染人群并不表现临床症状。同时，在Hp感染的消化性溃疡及胃癌患者中有一部分菌株往往cagA和VacA呈阴性表达。因此可以推测，除了上述毒力蛋白外，Hp可能还具有其他功能未知的蛋白参与了胃粘膜损伤[3，4]。Tipα基因位于菌株的Hp0596开放读码框，编码相对分子质量为38kd的蛋白，二聚体为其活性形式，在多种临床菌株中均可检测到Tipα蛋白表达。本实验通过构建重组质粒，体外克隆表达Tipα刺激巨噬细胞的方法，结果发现蛋白处理后，细胞致炎因子IL-1β和IL-6的表达增加，提示Tip仅可能通过诱导细胞致炎因子的高表达。在炎症长期存在下，可能引起细胞增殖与凋亡的异常，原癌基因与抑癌基因表达改变，最终参与胃癌的发生。为了进一步明确Tipα诱导IL-1β和IL-6产生的分子机制，我们采用Western blot检测了p38的磷酸化情况。结果显示，Tipα处理巨噬细胞5min后即可检测出明显的磷酸化p38，高峰在10～20min。而同时采用SB203580处理细胞，抑制p38通路后，IL-1β和IL-6分泌水平显著降低，这表明p38可能参与IL-1β和IL-6的分泌。总之，胃癌的发生是一个多因素、多步骤的复杂过程。Hp感染是诱发胃癌重要的危险因子，其发病机制尚不完全清楚。Tipα做为一种新的幽门螺杆菌毒素蛋白，在Hp致胃癌的发生中可能发挥重要的作用，但其具体作用机制尚待进一步研究。
参考文献：
[1]Correa P，Fox J，Fontham E，et al.Helicobacter pylori and gastric carcinoma.Serum antibody prevalence in population with contrasting cancer [J].risks J Cancer，1990，66（12）：2569-2574
[2]Go MF，Crowe SE.Virulence and pathogenicity of Helicobacter pylori[J].Gastroenterol
Clin North Am，2000，29（3）：649-670
[3]Suganuma M，Kurusu M，Suzuki K，et al.New tumor necrosis factor-a-inducing protein released from Helicobacter pylori for gastric cancer progression[J].J Cancer Res Clin Oncol，2005，131（5）：305-313
[4]程平，施瑞华，张红杰，等.幽门螺杆菌毒素蛋白Tipα对人胃黏膜上皮细胞株GES-1 的影响[J].中华医学杂志，2008，88（22）：1528-1532