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[摘 要] 目的 探讨肝硬化大鼠心肌中的β连环蛋白（β-catenin）表达，以阐明β-catenin在肝硬化大鼠心肌肥厚中的作用机制。方法 建立肝硬化大鼠模型，通过模型组和对照组比较，免疫组化法检测各组心肌组织中β-catenin表达水平;Western blot检测大鼠心肌中的β-catenin和Wnt诱导的分泌型蛋白1（WISP-1）表达差异。结果 模型组体重增长较慢，且小于对照组。免疫组化及Western blot结果显示对照组β-catenin蛋白的表达水平低，肝硬化模型组β-catenin蛋白的表达水平高，二者比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论 Wnt/β-catenin（Wnt/β-连环蛋白）信号通路参与肝硬化所致心肌肥厚的病理过程。
[关键词] 肝硬化;SD大鼠;心肌肥厚;Wnt/β-连环蛋白信号通路
中图分类号：R542.2;R575.2
文献标识码：A
文章编号：1009-816X（2019）03-0237-03
doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.03.012
国内外研究表明，在肝硬化患者中存在心肌异常，包括心肌肥厚、心肌细胞水肿、纤维化和渗出、细胞核空泡样变性。肝硬化患者心肌肥厚多发生于肝硬化早期，组织形态学改变包括心肌肥大、细胞间质和细胞内水肿、细胞损伤等，多表现为左心房心室肥大，左心室壁广泛变厚，且对室间隔壁的影响超过游离壁。已有研究发现肝硬化患者冠心病的风险明显增大[1]。早期肝硬化心肌病（cirrhotic cardio myopathy，CCM）缺乏统一的诊断标准，因此目前缺乏有关CCM的流行病学数据[2]。
Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路近年备受关注，Wnt诱导的分泌型蛋白1（WISP-1）受Wnt/β-catenin水平的调控，WISP-1是一个促进增生及纤维化的生长分子。Wnt/β-catenin信号通路除参与正常的生理过程外，还参与肿瘤发生和创伤修复过程，并在心脏发育过程中起双重作用，其稳定表达促进早期心肌细胞的产生，而抑制其表达是发育晚期心肌细胞分化所必须的。本研究旨在探讨肝硬化大鼠心肌中的β-catenin表达，以阐明Wnt/β-catenin信号通路在肝硬化大鼠心肌肥厚中的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器：SD雄性大鼠购自上海斯莱克有限公司，SCXK（沪）2017-0005，四氯化碳，茶油，β-catenin antibody一抗（abcam公司），二抗、DAB顯色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），苏木素（Sigma公司），显微镜：BX43型（OLYMPUS公司）。
1.2 方法：
1.2.1 肝硬化模型的构建：将23只SD大鼠随机分为模型组（15只）与对照组（8只），模型组按0.20mL/100g剂量腹腔注射40%四氯化碳茶油溶液，每周2次，连续8周。对照组给予相同浓度的食用油溶液腹腔注射。模型组和对照组同时以10%乙醇溶液为其唯一饮用水源。
1.2.2 超声心动图检测：对各组大鼠使用超声诊断仪进行检测，腹腔注射氯胺酮，将大鼠麻醉，胸部备皮后使用6-12MHz高频线阵探头每周经胸骨旁左心室长轴切面及腹主动脉的长轴切面连续检测室间隔舒张末期厚度（IVSTd），左心室后壁舒张末期厚度（LVPWTd）及左心室舒张末期内径（LVDd）。
1.2.3 免疫组化方法：至8周时，模型组随机取材3只大鼠肝脏做HE染色，证实肝硬化大鼠模型复制成功后取各组大鼠心尖组织给予脱蜡、复水、孵育、冲洗。分别滴加一抗，二抗孵育过夜（设置PBS替代一抗作为阴性对照）后染色，干燥封片。置于显微镜下观察，每张切片随机选3个不同视野（×200）观察，判读阳性表达强度和阳性率。
1.2.4 蛋白质印迹法（Western Blot）：剪切各组织于1.5离心管中，PBS洗一遍。收集细胞后，提取细胞总蛋白，BCA法测定其浓度。取50/lg蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE），转膜，分别用一抗和二抗与膜进行杂交反应。电泳后采用化学光敏模式进行曝光显影。ID数码成像分析系统软件（美国Bio-RAD公司）对Western印迹结果进行定量分析，积分吸光度值（IA）表示灰度值。
1.3 统计学分析：采用SPSS19.0版软件，计量资料用（x -±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组大鼠体重比较：模型组体重增长较慢，且小于对照组（P<0.05），见图1。
2.2 超声心动图结果：造模后，模型组大鼠IVSTd，LVPWTd及LVDd与对照组比较均有显著性变化，见表1。
2.3 HE染色结果：对照组心肌结构正常，细胞排列规则;模型组心肌组织结构松散，细胞排列紊乱，细胞间隙增大，部分心肌细胞肌丝溶解，有少量中性粒细胞浸润，细胞坏死或空泡化，图2见插页。
2.4 β-catenin免疫组化结果：β-catenin呈褐色或黄褐色表达，主要存在细胞膜，部分表达于胞浆。结果显示，β-catenin阳性表达模型组高于对照组，图3见插页。
2.5 Western blot结果：模型组β-catenin蛋白表达高于对照组，二者差异有统计学意义（P<0.01），见图4。
3 讨论
随着大量研究表明，肝硬化患者存在外周血管阻力下降、动脉压降低，心率、血容量、心输出量增加，这种高动力状态可由外周血管阻力下降、血容量分布异常、血管活动物质水平异常、神经体液调节紊乱引起，进一步导致心肌结构异常。肝硬化患者心肌对刺激的反应和心肌收缩力减弱，在应激状态下更为明显，严重时导致心力衰竭，该现象称为肝硬化心肌病（CCM）。但是因肝硬化患者外周血管阻力减小，心脏后负荷显著下降，从而掩盖严重心功能衰竭表现，导致临床表现隐匿[3]。 Wnt信號通路的主要成分包括：分泌蛋白Wnt家族，跨膜受体Frizzled家族，CK1，Deshevelled，GSK3，APC，Axin，β-catenin以及转录因子TCF/LEF家族。Wnt信号通路认为它包括三个分支：经典Wnt信号通路;Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路。Wnt信号途径能引起细胞β-catenin积累。游离的β-catenin可进入细胞核，调节基因表达。
心脏对容量或压力超负荷可表现出适应性反应，通常是心肌肥厚。研究表明，肾素-血管紧张素-醛固酮系统及RAS/RAF/MEK/ERK、RAF/NF-KB等信号传导及体液因素是重要原因。Wnt信号水平的高表达在某些病理情况下对心肌重塑也发挥着重要作用[4，5]。β-catenin是一种多功能蛋白质，作为经典Wnt信号通路的第二信使，在肥厚因素刺激下，能引起心肌肥厚[6]。Baurand等[7]却发现，在研究血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚的小鼠模型中，β-catenin基因敲除组的心肌肥厚较β-catenin稳定表达组更显著。
根据国内外的研究，本文想到对于肝硬化患者是否Wnt信号通路在其引起的心肌肥厚病理变化中亦起重要作用。本研究表明两组比较，模型组体重增长较慢，且小于对照组。免疫组化及Western blot结果显示对照组β-catenin蛋白的表达水平低于模型组，二者比较有较显著性差异（P<0.01）。β-catenin在肝硬化所致心肌肥厚的病理过程中发挥了一定的作用。
本研究显示早期干预阻断，可减轻肝硬化患者的心脏病理及生理改变，从而为广大肝硬化患者的治疗带来更广阔的前景。
参考文献
[1]Wehmeyer MH， Heuer AJ， Benten D， et al. High rate of cardiac abnormalities in a postmortem analysis of patients suffering from liver cirrhosis[J]. J Clin Gastroenterol，2015，49（10）：866-872.
[2]Gassanov N， Caglayan E， Semmo N， et al. Cirrhotic cardiomyopathy： A cardiologist’s perspective[J]. World J Gastroenterol，2014，20（42）：15492-15498.
[3]Moller S， Krag A， Bendtsen F. Kidney injury in cirrhosis： patho-physiological and therapeutic aspects of hepatorenal syndromes[J]. Liver Int，2014，34（8）：1153-1163.
[4]Malekar P， Hagenmueller M， Anyanwu A， et al. Wnt signalingis critical for maladaptive cardiac hypertrophy and acceleratesmyocardial remodeling[J]. Hypertension，2010，55（4）：939-945.
[5]Zelarayan LC， Noack C， Zafiriou MP， et al. Wnt signaling molecules in left ventficular remodeling： focus on dishevlled 1[J]. Hypertension，2010，55（4）：852-854.
[6]Duan J， Gherghe C， Liu D， et al. Wntl/betacatenin injury re-sponse activates the epieardium and cardiac fi bmblasts to pro-mote cardiac repair[J]. EMBO J，2012，31（2）：429-442.
[7]Baurand A， Zelarayan L， Betney R， et al. B-catenin downregulation is required for adaptive cardiac remodeling[J]. CircRes，2007，100（9）：1353-1362.
（收稿日期：2018-11-26）
[关键词] 肝硬化;SD大鼠;心肌肥厚;Wnt/β-连环蛋白信号通路
中图分类号：R542.2;R575.2
文献标识码：A
文章编号：1009-816X（2019）03-0237-03
doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.03.012
国内外研究表明，在肝硬化患者中存在心肌异常，包括心肌肥厚、心肌细胞水肿、纤维化和渗出、细胞核空泡样变性。肝硬化患者心肌肥厚多发生于肝硬化早期，组织形态学改变包括心肌肥大、细胞间质和细胞内水肿、细胞损伤等，多表现为左心房心室肥大，左心室壁广泛变厚，且对室间隔壁的影响超过游离壁。已有研究发现肝硬化患者冠心病的风险明显增大[1]。早期肝硬化心肌病（cirrhotic cardio myopathy，CCM）缺乏统一的诊断标准，因此目前缺乏有关CCM的流行病学数据[2]。
Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路近年备受关注，Wnt诱导的分泌型蛋白1（WISP-1）受Wnt/β-catenin水平的调控，WISP-1是一个促进增生及纤维化的生长分子。Wnt/β-catenin信号通路除参与正常的生理过程外，还参与肿瘤发生和创伤修复过程，并在心脏发育过程中起双重作用，其稳定表达促进早期心肌细胞的产生，而抑制其表达是发育晚期心肌细胞分化所必须的。本研究旨在探讨肝硬化大鼠心肌中的β-catenin表达，以阐明Wnt/β-catenin信号通路在肝硬化大鼠心肌肥厚中的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器：SD雄性大鼠购自上海斯莱克有限公司，SCXK（沪）2017-0005，四氯化碳，茶油，β-catenin antibody一抗（abcam公司），二抗、DAB顯色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），苏木素（Sigma公司），显微镜：BX43型（OLYMPUS公司）。
1.2 方法：
1.2.1 肝硬化模型的构建：将23只SD大鼠随机分为模型组（15只）与对照组（8只），模型组按0.20mL/100g剂量腹腔注射40%四氯化碳茶油溶液，每周2次，连续8周。对照组给予相同浓度的食用油溶液腹腔注射。模型组和对照组同时以10%乙醇溶液为其唯一饮用水源。
1.2.2 超声心动图检测：对各组大鼠使用超声诊断仪进行检测，腹腔注射氯胺酮，将大鼠麻醉，胸部备皮后使用6-12MHz高频线阵探头每周经胸骨旁左心室长轴切面及腹主动脉的长轴切面连续检测室间隔舒张末期厚度（IVSTd），左心室后壁舒张末期厚度（LVPWTd）及左心室舒张末期内径（LVDd）。
1.2.3 免疫组化方法：至8周时，模型组随机取材3只大鼠肝脏做HE染色，证实肝硬化大鼠模型复制成功后取各组大鼠心尖组织给予脱蜡、复水、孵育、冲洗。分别滴加一抗，二抗孵育过夜（设置PBS替代一抗作为阴性对照）后染色，干燥封片。置于显微镜下观察，每张切片随机选3个不同视野（×200）观察，判读阳性表达强度和阳性率。
1.2.4 蛋白质印迹法（Western Blot）：剪切各组织于1.5离心管中，PBS洗一遍。收集细胞后，提取细胞总蛋白，BCA法测定其浓度。取50/lg蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE），转膜，分别用一抗和二抗与膜进行杂交反应。电泳后采用化学光敏模式进行曝光显影。ID数码成像分析系统软件（美国Bio-RAD公司）对Western印迹结果进行定量分析，积分吸光度值（IA）表示灰度值。
1.3 统计学分析：采用SPSS19.0版软件，计量资料用（x -±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组大鼠体重比较：模型组体重增长较慢，且小于对照组（P<0.05），见图1。
2.2 超声心动图结果：造模后，模型组大鼠IVSTd，LVPWTd及LVDd与对照组比较均有显著性变化，见表1。
2.3 HE染色结果：对照组心肌结构正常，细胞排列规则;模型组心肌组织结构松散，细胞排列紊乱，细胞间隙增大，部分心肌细胞肌丝溶解，有少量中性粒细胞浸润，细胞坏死或空泡化，图2见插页。
2.4 β-catenin免疫组化结果：β-catenin呈褐色或黄褐色表达，主要存在细胞膜，部分表达于胞浆。结果显示，β-catenin阳性表达模型组高于对照组，图3见插页。
2.5 Western blot结果：模型组β-catenin蛋白表达高于对照组，二者差异有统计学意义（P<0.01），见图4。
3 讨论
随着大量研究表明，肝硬化患者存在外周血管阻力下降、动脉压降低，心率、血容量、心输出量增加，这种高动力状态可由外周血管阻力下降、血容量分布异常、血管活动物质水平异常、神经体液调节紊乱引起，进一步导致心肌结构异常。肝硬化患者心肌对刺激的反应和心肌收缩力减弱，在应激状态下更为明显，严重时导致心力衰竭，该现象称为肝硬化心肌病（CCM）。但是因肝硬化患者外周血管阻力减小，心脏后负荷显著下降，从而掩盖严重心功能衰竭表现，导致临床表现隐匿[3]。 Wnt信號通路的主要成分包括：分泌蛋白Wnt家族，跨膜受体Frizzled家族，CK1，Deshevelled，GSK3，APC，Axin，β-catenin以及转录因子TCF/LEF家族。Wnt信号通路认为它包括三个分支：经典Wnt信号通路;Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路。Wnt信号途径能引起细胞β-catenin积累。游离的β-catenin可进入细胞核，调节基因表达。
心脏对容量或压力超负荷可表现出适应性反应，通常是心肌肥厚。研究表明，肾素-血管紧张素-醛固酮系统及RAS/RAF/MEK/ERK、RAF/NF-KB等信号传导及体液因素是重要原因。Wnt信号水平的高表达在某些病理情况下对心肌重塑也发挥着重要作用[4，5]。β-catenin是一种多功能蛋白质，作为经典Wnt信号通路的第二信使，在肥厚因素刺激下，能引起心肌肥厚[6]。Baurand等[7]却发现，在研究血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚的小鼠模型中，β-catenin基因敲除组的心肌肥厚较β-catenin稳定表达组更显著。
根据国内外的研究，本文想到对于肝硬化患者是否Wnt信号通路在其引起的心肌肥厚病理变化中亦起重要作用。本研究表明两组比较，模型组体重增长较慢，且小于对照组。免疫组化及Western blot结果显示对照组β-catenin蛋白的表达水平低于模型组，二者比较有较显著性差异（P<0.01）。β-catenin在肝硬化所致心肌肥厚的病理过程中发挥了一定的作用。
本研究显示早期干预阻断，可减轻肝硬化患者的心脏病理及生理改变，从而为广大肝硬化患者的治疗带来更广阔的前景。
参考文献
[1]Wehmeyer MH， Heuer AJ， Benten D， et al. High rate of cardiac abnormalities in a postmortem analysis of patients suffering from liver cirrhosis[J]. J Clin Gastroenterol，2015，49（10）：866-872.
[2]Gassanov N， Caglayan E， Semmo N， et al. Cirrhotic cardiomyopathy： A cardiologist’s perspective[J]. World J Gastroenterol，2014，20（42）：15492-15498.
[3]Moller S， Krag A， Bendtsen F. Kidney injury in cirrhosis： patho-physiological and therapeutic aspects of hepatorenal syndromes[J]. Liver Int，2014，34（8）：1153-1163.
[4]Malekar P， Hagenmueller M， Anyanwu A， et al. Wnt signalingis critical for maladaptive cardiac hypertrophy and acceleratesmyocardial remodeling[J]. Hypertension，2010，55（4）：939-945.
[5]Zelarayan LC， Noack C， Zafiriou MP， et al. Wnt signaling molecules in left ventficular remodeling： focus on dishevlled 1[J]. Hypertension，2010，55（4）：852-854.
[6]Duan J， Gherghe C， Liu D， et al. Wntl/betacatenin injury re-sponse activates the epieardium and cardiac fi bmblasts to pro-mote cardiac repair[J]. EMBO J，2012，31（2）：429-442.
[7]Baurand A， Zelarayan L， Betney R， et al. B-catenin downregulation is required for adaptive cardiac remodeling[J]. CircRes，2007，100（9）：1353-1362.
（收稿日期：2018-11-26）