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摘要：建立滇桂艾纳香胶囊的微生物限度检验方法。采用常规法对样品进行方法验证。结果五种规定试验菌的回收率均不低于70%，可用于滇桂艾纳香胶囊的微生物限度检验。
关键词：滇桂艾纳香胶囊；微生物限度检查；方法验证 【中图分类号】R285 【文献标识码】B 【文章编号】1672-8602(2014)03-0197-01
滇桂艾纳香胶囊具有活血化瘀，止血调经。用于瘀血阻滞所致的月经量多，经期延长。主要成份为滇桂艾纳香。根据其制剂用药途径，应进行细菌数、霉菌和酵母菌数的测定、及控制菌——大肠埃希菌检查。经实验研究，确定采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌检查。经对所确定的方法进行验证，符合2010年版《中国药典》一部附录ⅧC有关微生物限度检查法有关规定，方法可行。
1 实验仪器、试药
1.1 实验菌种:枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003。
1.2 样品：风湿灵片
1.3 培养基及稀释剂:营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，胆盐乳糖培养基（BL）,改良马丁培养基，MUG培养基，曙红亚甲蓝琼脂培养基， pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，0.9%无菌氯化钠溶液等。
1.4 仪器:培养箱、高压蒸汽灭菌器等。
2 细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法的建立及验证
2.1 菌液制备:取经35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用；取经25℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液,备用；取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加10 ml 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用。
2.2 供试液的制备方法:常规法：取样品10g，用pH7.0無菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1：10的供试液；取1：10的供试液1ml注皿。
2.3 回收率试验:试验组：同2.2，另分别取各试验菌50～100CFU，分别注入同一平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h。菌液组：取试验菌50～100CFU注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h，测定所加入的试验菌数，平行制备2个平皿。供试品对照组：同2.2，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，霉菌和酵母菌培养48～72h，测定供试品本底菌数。
2.4 方法的确定:选用金黄色葡萄球菌、白色念珠菌作为敏感菌株进行预试验，结果：金黄色葡萄球菌回收率为93%，白色念珠菌回收率为86%，表明风湿灵片对细菌、真菌没有抑制作用，采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数测定可行。pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释剂无抑菌作用，对实验无干扰。
2.5 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证:取3个批号滇桂艾纳香胶囊样品，细菌数、霉菌及酵母菌数按常规法进行加菌回收率试验，结果见表1
批号 回收率
大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉
11030180% 84% 90%98% 85%
11040190%94%92% 93% 100%
11050195%90% 92% 90%96%
三个批号样品的验证试验结果表明，以常规法进行滇桂艾纳香胶囊细菌数、霉菌及酵母菌数测定，五种规定试验菌的回收率均大于70%，符合《中国药典》的规定，方法可行。确定滇桂艾纳香胶囊细菌数、霉菌及酵母菌数计数方法为常规法。
3 控制菌检验方法的建立及验证
菌液制备同2.1。
3.1 大肠埃希菌检查方法:常规法：取1：10供试液10ml接种至100ml胆盐乳糖培养基，同时加入大肠埃希菌10～100CFU，35℃培养24～48h。取培养物0.2ml接种至含5ml MUG培养基的试管中，35℃培养24h左右，366nm紫外灯下观察荧光，然后进行靛基质试验，观察结果；另取培养物划线接种于曙红亚甲蓝（EMB）平板，35℃培养18～24h，观察其菌落形态。
3.2 大肠埃希菌试验结果:经胆盐乳糖（BL）培养基培养后，试验组与阴性对照组相比较有明显的变化，试验组有明显产酸产气现象，结果如表2
大肠埃希菌 试验组 阳性对照 阴性对照
BL - + ―
MUG，靛基质 - - + ―
EMB平板 -+―
4 结语
根据上述实验结果，拟定滇桂艾纳香胶囊微生物限度检查法标准正文如下：微生物限度 照微生物限度检查法（《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ）。取本品10g，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制成1：10的供试液。细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌 取1：10的供试液，采用常规法，依法检查，应符合规定。细菌数每1g不得过1000cfu，霉菌和酵母菌数每1g不得过100cfu，大肠埃希菌每1g不得检出。
5 三批滇桂艾纳香胶囊的微生物限度检查
按上述所建立的滇桂艾纳香胶囊微生物限度检查法，对三批样品进行检验，结果见表3
批号 细菌数霉菌、酵母菌数 大肠埃希菌 结论
110301 120个/g15个/g 未检出 符合规定
110401 80个/g10个/g 未检出 符合规定
110501 90个/g 20个/g未检出 符合规定
参考文献
[1] 2010年版《中国药典》一部.
关键词：滇桂艾纳香胶囊；微生物限度检查；方法验证 【中图分类号】R285 【文献标识码】B 【文章编号】1672-8602(2014)03-0197-01
滇桂艾纳香胶囊具有活血化瘀，止血调经。用于瘀血阻滞所致的月经量多，经期延长。主要成份为滇桂艾纳香。根据其制剂用药途径，应进行细菌数、霉菌和酵母菌数的测定、及控制菌——大肠埃希菌检查。经实验研究，确定采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌检查。经对所确定的方法进行验证，符合2010年版《中国药典》一部附录ⅧC有关微生物限度检查法有关规定，方法可行。
1 实验仪器、试药
1.1 实验菌种:枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003。
1.2 样品：风湿灵片
1.3 培养基及稀释剂:营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，胆盐乳糖培养基（BL）,改良马丁培养基，MUG培养基，曙红亚甲蓝琼脂培养基， pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，0.9%无菌氯化钠溶液等。
1.4 仪器:培养箱、高压蒸汽灭菌器等。
2 细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法的建立及验证
2.1 菌液制备:取经35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用；取经25℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液,备用；取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加10 ml 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用。
2.2 供试液的制备方法:常规法：取样品10g，用pH7.0無菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1：10的供试液；取1：10的供试液1ml注皿。
2.3 回收率试验:试验组：同2.2，另分别取各试验菌50～100CFU，分别注入同一平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h。菌液组：取试验菌50～100CFU注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h，测定所加入的试验菌数，平行制备2个平皿。供试品对照组：同2.2，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，霉菌和酵母菌培养48～72h，测定供试品本底菌数。
2.4 方法的确定:选用金黄色葡萄球菌、白色念珠菌作为敏感菌株进行预试验，结果：金黄色葡萄球菌回收率为93%，白色念珠菌回收率为86%，表明风湿灵片对细菌、真菌没有抑制作用，采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数测定可行。pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释剂无抑菌作用，对实验无干扰。
2.5 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证:取3个批号滇桂艾纳香胶囊样品，细菌数、霉菌及酵母菌数按常规法进行加菌回收率试验，结果见表1
批号 回收率
大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉
11030180% 84% 90%98% 85%
11040190%94%92% 93% 100%
11050195%90% 92% 90%96%
三个批号样品的验证试验结果表明，以常规法进行滇桂艾纳香胶囊细菌数、霉菌及酵母菌数测定，五种规定试验菌的回收率均大于70%，符合《中国药典》的规定，方法可行。确定滇桂艾纳香胶囊细菌数、霉菌及酵母菌数计数方法为常规法。
3 控制菌检验方法的建立及验证
菌液制备同2.1。
3.1 大肠埃希菌检查方法:常规法：取1：10供试液10ml接种至100ml胆盐乳糖培养基，同时加入大肠埃希菌10～100CFU，35℃培养24～48h。取培养物0.2ml接种至含5ml MUG培养基的试管中，35℃培养24h左右，366nm紫外灯下观察荧光，然后进行靛基质试验，观察结果；另取培养物划线接种于曙红亚甲蓝（EMB）平板，35℃培养18～24h，观察其菌落形态。
3.2 大肠埃希菌试验结果:经胆盐乳糖（BL）培养基培养后，试验组与阴性对照组相比较有明显的变化，试验组有明显产酸产气现象，结果如表2
大肠埃希菌 试验组 阳性对照 阴性对照
BL - + ―
MUG，靛基质 - - + ―
EMB平板 -+―
4 结语
根据上述实验结果，拟定滇桂艾纳香胶囊微生物限度检查法标准正文如下：微生物限度 照微生物限度检查法（《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ）。取本品10g，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制成1：10的供试液。细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌 取1：10的供试液，采用常规法，依法检查，应符合规定。细菌数每1g不得过1000cfu，霉菌和酵母菌数每1g不得过100cfu，大肠埃希菌每1g不得检出。
5 三批滇桂艾纳香胶囊的微生物限度检查
按上述所建立的滇桂艾纳香胶囊微生物限度检查法，对三批样品进行检验，结果见表3
批号 细菌数霉菌、酵母菌数 大肠埃希菌 结论
110301 120个/g15个/g 未检出 符合规定
110401 80个/g10个/g 未检出 符合规定
110501 90个/g 20个/g未检出 符合规定
参考文献
[1] 2010年版《中国药典》一部.