论文部分内容阅读
【摘 要】 目的 对3种通过美国国家糖化血红蛋白标准化计划（NGSP）认证的检测方法进行方法学评价以及探讨糖化血红蛋白检测标准化的意义。方法 用离子交换高效液相层析（HPLC）法（X）、硼酸亲和色谱层析法（Y1）、酶法（Y2）测定40例糖化血红蛋白样本，进行精密度分析、偏倚分析、回归分析。结果 X、Y1、Y2方法测定的精密度均不大于2%；X-Y1、X-Y2中都不存在离群值、所有的数据偏差都在6%的范围内；X-Y1的回归方程为y=0.9968x+0.1785（r=0.9981，Syx=0.092），X-Y2的回归方程为y=0.9569x+0.2449（r=0.9862，Syx=0.243）。结论 和HPLC法相比，硼酸亲和色谱层析法以及酶法的精密度均可以接受，糖化血红蛋白检测标准化使采用不同厂商、不同方法、不同试剂测定同一份样本的结果应该是可比的。
【关键词】 糖化血红蛋白 高效液相色谱法 硼酸亲和色谱层析法 酶法 NGSP
Evaluation and Standardization of HbA1c with different Test Method
Huang Chi Zhang Wenjian Ma Jie
430015，Clinical Laboratory of Xinhua Hospital，Hubei Province，Hubei Wuhan
【Abstract】 Purpose Evaluate 3 methods that obtains NGSP certification and discuss about the significance of the standardization of HbA1c tests. Method Test 40 HbA1c samples by using HPLC（X）， boronic affinity chromatography（Y1） and enzymic method（Y2） to analyze their precision， bias and regression. Results The precision using X， Y1， Y2 are all no more than 2%； no outlier exists in X-Y1 or X-Y2， and data deviation are within 6%； the regression equation of X-Y1 is y=0.9968x+0.1785（r=0.9981，Syx=0.092）and the regression equation of X-Y2 is y=0.9569x+0.2449（r=0.9862，Syx=0.243）.Conclusion Compared to HPLC， the precision of boronic affinity chromatography and enzymic method are acceptable.The standardization of HbA1c test makes result of which test the same sample using different manufacturers， different methods and different reagents comparable.
【Key words】 HbA1c，HPLC， boronic affinity chromatography， enzymic method，NGSP
HbA1c是红细胞血红蛋白的β链N端缬氨酸与葡萄糖结合的产物，正常占糖化血红蛋白总量的60%～70%。红细胞寿命是120天，所以HbA1c可以反映近3个月的血糖平均水平[1]。目前临床实验室普遍采用的 HbA1c测定方法有多种，按原理可分为两大类：一类是基于糖化与非糖化血红蛋白所带电荷不同，如离子交换层析法，电泳法；另一类是基于糖化与非糖化血红蛋白的结构不同，如免疫法、亲和层析法及酶法等[2]。
在2009年7月 《Diabetes care》发表了《国际专家委员会对糖化血红蛋白（HbA1c）对诊断糖尿病的作用的声明》， 声明提出用HbA1c作为糖尿病的诊断标准，这是糖尿病诊断标准的发展历史中的一次重大变革，同时也要求糖化血红蛋白的实验室检测的精密度和准确度应进一步提高。国内第一家硼酸亲和色谱层析法糖化血红蛋白检测试剂是由广东优尼德生物科技有限公司自主研制的，于2015年2月获得国家药监局的上市批文，同年5月获得了NGSP的认证。2014年9-10月在我院进行了上市前的临床试验，与我院目前使用的伯乐D-10糖化血红蛋白测试系统以及积水医疗株式会社生产的糖化血红蛋白酶法试剂进行了盲样比对，分别对40份临床样本进行检测，对检测结果进行统计分析，旨在探讨糖化血红蛋白检测标准化意义。
1 材料和方法
1.1 标本来源
按照NGSP认证程序的要求：收集EDTA的抗凝的静脉全血样本合计40例，每例2ml，每个样本的HbF的含量不高于5%且浓度的分布符合表1规定。
1.2 检测系统：
1.2.1 检测系统1：伯乐D-10糖化血红蛋白测试系统，试剂：伯乐配套糖化血红蛋白检测试剂盒（HPLC法），试剂盒批号：AA40245
1.2.2 检测系统2：日立7600全自动生化分析仪，试剂：积水医疗株式会社生产的糖化血红蛋白检测试剂盒（酶法），试剂盒批号：813RLL
1.2.3 检测系统3：广东优尼德生物科技有限公司UNT4000糖化血红蛋白分析仪，试剂：糖化血红蛋白检测试剂盒（硼酸亲和色谱层析法），试剂盒批号：0120150518 1.2.4 其他耗材 移液枪、微量采血管、EDTA抗凝管等。
1.3 方法
各检测系统的操作均按各自仪器/试剂盒说明书进行。
1.4 统计学方法
1.4.1 精密度计算多次重复测量的平均值以及SD，；
1.4.2 偏倚：计算的值，并做出偏倚图；
1.4.3 计算X-Y1、X-Y2的回归方程并分析。
2 结果
2.1 精密度
取高、低值两个浓度的样本进行精密度测试，每个浓度分别用三种方法学的试剂各测试10次，结果见表2。
2.2 偏倚
2.2.1 UNT4000以及D-10的比对的离群值检验的结果见表3，偏倚的散点图见表4。
2.2.2 积水酶法以及D-10的比对的离群值检验的结果见表5，偏倚的散点图见表6。
2.2.3 通过计算40次测定结果的差值的平均值（以及SD，以为上下限，两组试验中均没有离群值。同时按照NGSP认证的要求，37/40样本的偏差应在6%的范围内，UNT4000以及积水酶法的试剂的偏倚均可接受。
2.3 回归以及分析
2.3.1 UNT4000&D-10回归及分析见表7。
2.3.2积水酶法&D-10回归及分析见表8。
2.3.3 结论
2.3.3.1 UNT4000&D-10 对回归方程的截距、回归系数、相关系数进行假设检验，结果如下见表9。
2.3.3.2 积水酶法&D-10对回归方程的截距、回归系数、相关系数进行假设检验，结果如下见表10。
3 讨论
3.1 三种糖化血红蛋白检测的方法学精密度、相关性均很好。与高效液相色谱法相比较，硼酸亲和色谱法以及酶法检测结果的一致性程度高。
3.2 1984年首次提出其糖化血红蛋白标准化测定的问题[3]，但直到1993年在美国开展的糖尿病控制和并发症临床研究（diabetes control and complications trial， DCCT）表明了糖尿病患者病程的发展与血糖控制的密切关系，及血浆葡萄糖水平与HbA1c水平间的关系研究发表后，才引起科学家和临床医师重视[4]。在此基础上，美国糖尿病协会（American Diabetes Association）提出了糖尿病治疗的建议，指明测定HbA1c重要性，并在世界范围内被广泛应用[5]。为了更好地应用DCCT的结果治疗糖尿病人，为临床医生提供准确的实验室数据，美国临床化学协会（AACC）在1993年成立分委会进行GHB测定的标准化工作，使不同实验室（方法）的结果可溯源至DCCT的参考结果。目前比较公认的是美国国家糖化血红蛋白标准化计划（NGSP）[6]，其主要依据DCCT中使用的高效液相色谱（HPLC）法。另外，为了满足全球测定标准化的要求，达到欧盟对诊断性医疗仪器（IVD）的要求，国际临床化学和实验室医学联盟（IFCC） 成立了专门的工作组，研究一个可供追溯的参照系统[7]。这也是我国2015年度多个检验学术会议上的热门议题。
3.3 随着对于糖化血红蛋白认识的提高，2014年我国出台了《糖化血红蛋白测定专家共识》[8]，对于提高国内HbA1c测定质量，适应临床应用的需要，更科学、合理、有效地运用HbA1c并发挥其作用有着深远的意义。同时该共识也指出，目前国内POCT方法用于测定糖化血红蛋白的的精密性、准确性无法满足临床需求，不能用于糖尿病诊断。这与国内仅有极少数方法学能通过NGSP认证的情况吻合，各临床实验室在选择/采购用于糖化血红蛋白分析的试剂/分析系统的时候应选用测定结果可溯源至IFCC参考方法的分析系统，如：获得NGSP/IFCC认证。
3.4 目前上海的糖化血红蛋白标准化已经走在了国内的前列，上海地区拟定了糖化血红蛋白一致性计划[9]。目前，上海市有85家医院通过参加该计划，使自身HbA1c检测结果的准确性和精密度得到保障，实验室总变异系数（CV）明显下降。但值得关注的是，对上海市部分医院进行的HbA1c检测结果调查显示，参与研究的31家临床实验室中仅有7家符合NGSP相关检测标准的精密度及准确性要求[10]。这意味着，我国临床实验室HbA1c检测亟需标准化，以保证各实验室检测结果的准确、一致。
3.5 目前我国自主生产的糖化血红蛋白检测系统通过NGSP认证的仅有六个产品，广东优尼德生物科技有限公司生产的POCT糖化血红蛋白分析仪第一家通过NGSP认证，本研究结果显示：其检测结果与目前公认的高效液相色谱法检测结果比较有高度的相关性，由于其便捷、快速，适应于各级临床实验室使用，其广泛地应用于临床，必将促进我国各级医疗机构包括社区服务中心在内的糖化血红蛋白检测标准化检测的发展。
参考文献
[1] 周新，涂植光.临床生物化学和生物化学检验[M].3版.北京：人民卫生出版社，2006：89.
[2] Goodall I，Colman PG，Schneider HG，et al. Desirable performance standards for HbA（1c） analysis-precision，accuracy and standardization： consensus statement of the Australasian Association of Clinical Biochemists（ AACB） ，the Australian Diabetes Society（ADS） ，the Royal College of Pathologists of Australasia（RCPA），Endocrine Society of Australia（ESA），and the Australian Diabetes Educators Association（ ADEA） [J].Clin Chem Lab Med，2007，45（8） ：1083-1097.
【关键词】 糖化血红蛋白 高效液相色谱法 硼酸亲和色谱层析法 酶法 NGSP
Evaluation and Standardization of HbA1c with different Test Method
Huang Chi Zhang Wenjian Ma Jie
430015，Clinical Laboratory of Xinhua Hospital，Hubei Province，Hubei Wuhan
【Abstract】 Purpose Evaluate 3 methods that obtains NGSP certification and discuss about the significance of the standardization of HbA1c tests. Method Test 40 HbA1c samples by using HPLC（X）， boronic affinity chromatography（Y1） and enzymic method（Y2） to analyze their precision， bias and regression. Results The precision using X， Y1， Y2 are all no more than 2%； no outlier exists in X-Y1 or X-Y2， and data deviation are within 6%； the regression equation of X-Y1 is y=0.9968x+0.1785（r=0.9981，Syx=0.092）and the regression equation of X-Y2 is y=0.9569x+0.2449（r=0.9862，Syx=0.243）.Conclusion Compared to HPLC， the precision of boronic affinity chromatography and enzymic method are acceptable.The standardization of HbA1c test makes result of which test the same sample using different manufacturers， different methods and different reagents comparable.
【Key words】 HbA1c，HPLC， boronic affinity chromatography， enzymic method，NGSP
HbA1c是红细胞血红蛋白的β链N端缬氨酸与葡萄糖结合的产物，正常占糖化血红蛋白总量的60%～70%。红细胞寿命是120天，所以HbA1c可以反映近3个月的血糖平均水平[1]。目前临床实验室普遍采用的 HbA1c测定方法有多种，按原理可分为两大类：一类是基于糖化与非糖化血红蛋白所带电荷不同，如离子交换层析法，电泳法；另一类是基于糖化与非糖化血红蛋白的结构不同，如免疫法、亲和层析法及酶法等[2]。
在2009年7月 《Diabetes care》发表了《国际专家委员会对糖化血红蛋白（HbA1c）对诊断糖尿病的作用的声明》， 声明提出用HbA1c作为糖尿病的诊断标准，这是糖尿病诊断标准的发展历史中的一次重大变革，同时也要求糖化血红蛋白的实验室检测的精密度和准确度应进一步提高。国内第一家硼酸亲和色谱层析法糖化血红蛋白检测试剂是由广东优尼德生物科技有限公司自主研制的，于2015年2月获得国家药监局的上市批文，同年5月获得了NGSP的认证。2014年9-10月在我院进行了上市前的临床试验，与我院目前使用的伯乐D-10糖化血红蛋白测试系统以及积水医疗株式会社生产的糖化血红蛋白酶法试剂进行了盲样比对，分别对40份临床样本进行检测，对检测结果进行统计分析，旨在探讨糖化血红蛋白检测标准化意义。
1 材料和方法
1.1 标本来源
按照NGSP认证程序的要求：收集EDTA的抗凝的静脉全血样本合计40例，每例2ml，每个样本的HbF的含量不高于5%且浓度的分布符合表1规定。
1.2 检测系统：
1.2.1 检测系统1：伯乐D-10糖化血红蛋白测试系统，试剂：伯乐配套糖化血红蛋白检测试剂盒（HPLC法），试剂盒批号：AA40245
1.2.2 检测系统2：日立7600全自动生化分析仪，试剂：积水医疗株式会社生产的糖化血红蛋白检测试剂盒（酶法），试剂盒批号：813RLL
1.2.3 检测系统3：广东优尼德生物科技有限公司UNT4000糖化血红蛋白分析仪，试剂：糖化血红蛋白检测试剂盒（硼酸亲和色谱层析法），试剂盒批号：0120150518 1.2.4 其他耗材 移液枪、微量采血管、EDTA抗凝管等。
1.3 方法
各检测系统的操作均按各自仪器/试剂盒说明书进行。
1.4 统计学方法
1.4.1 精密度计算多次重复测量的平均值以及SD，；
1.4.2 偏倚：计算的值，并做出偏倚图；
1.4.3 计算X-Y1、X-Y2的回归方程并分析。
2 结果
2.1 精密度
取高、低值两个浓度的样本进行精密度测试，每个浓度分别用三种方法学的试剂各测试10次，结果见表2。
2.2 偏倚
2.2.1 UNT4000以及D-10的比对的离群值检验的结果见表3，偏倚的散点图见表4。
2.2.2 积水酶法以及D-10的比对的离群值检验的结果见表5，偏倚的散点图见表6。
2.2.3 通过计算40次测定结果的差值的平均值（以及SD，以为上下限，两组试验中均没有离群值。同时按照NGSP认证的要求，37/40样本的偏差应在6%的范围内，UNT4000以及积水酶法的试剂的偏倚均可接受。
2.3 回归以及分析
2.3.1 UNT4000&D-10回归及分析见表7。
2.3.2积水酶法&D-10回归及分析见表8。
2.3.3 结论
2.3.3.1 UNT4000&D-10 对回归方程的截距、回归系数、相关系数进行假设检验，结果如下见表9。
2.3.3.2 积水酶法&D-10对回归方程的截距、回归系数、相关系数进行假设检验，结果如下见表10。
3 讨论
3.1 三种糖化血红蛋白检测的方法学精密度、相关性均很好。与高效液相色谱法相比较，硼酸亲和色谱法以及酶法检测结果的一致性程度高。
3.2 1984年首次提出其糖化血红蛋白标准化测定的问题[3]，但直到1993年在美国开展的糖尿病控制和并发症临床研究（diabetes control and complications trial， DCCT）表明了糖尿病患者病程的发展与血糖控制的密切关系，及血浆葡萄糖水平与HbA1c水平间的关系研究发表后，才引起科学家和临床医师重视[4]。在此基础上，美国糖尿病协会（American Diabetes Association）提出了糖尿病治疗的建议，指明测定HbA1c重要性，并在世界范围内被广泛应用[5]。为了更好地应用DCCT的结果治疗糖尿病人，为临床医生提供准确的实验室数据，美国临床化学协会（AACC）在1993年成立分委会进行GHB测定的标准化工作，使不同实验室（方法）的结果可溯源至DCCT的参考结果。目前比较公认的是美国国家糖化血红蛋白标准化计划（NGSP）[6]，其主要依据DCCT中使用的高效液相色谱（HPLC）法。另外，为了满足全球测定标准化的要求，达到欧盟对诊断性医疗仪器（IVD）的要求，国际临床化学和实验室医学联盟（IFCC） 成立了专门的工作组，研究一个可供追溯的参照系统[7]。这也是我国2015年度多个检验学术会议上的热门议题。
3.3 随着对于糖化血红蛋白认识的提高，2014年我国出台了《糖化血红蛋白测定专家共识》[8]，对于提高国内HbA1c测定质量，适应临床应用的需要，更科学、合理、有效地运用HbA1c并发挥其作用有着深远的意义。同时该共识也指出，目前国内POCT方法用于测定糖化血红蛋白的的精密性、准确性无法满足临床需求，不能用于糖尿病诊断。这与国内仅有极少数方法学能通过NGSP认证的情况吻合，各临床实验室在选择/采购用于糖化血红蛋白分析的试剂/分析系统的时候应选用测定结果可溯源至IFCC参考方法的分析系统，如：获得NGSP/IFCC认证。
3.4 目前上海的糖化血红蛋白标准化已经走在了国内的前列，上海地区拟定了糖化血红蛋白一致性计划[9]。目前，上海市有85家医院通过参加该计划，使自身HbA1c检测结果的准确性和精密度得到保障，实验室总变异系数（CV）明显下降。但值得关注的是，对上海市部分医院进行的HbA1c检测结果调查显示，参与研究的31家临床实验室中仅有7家符合NGSP相关检测标准的精密度及准确性要求[10]。这意味着，我国临床实验室HbA1c检测亟需标准化，以保证各实验室检测结果的准确、一致。
3.5 目前我国自主生产的糖化血红蛋白检测系统通过NGSP认证的仅有六个产品，广东优尼德生物科技有限公司生产的POCT糖化血红蛋白分析仪第一家通过NGSP认证，本研究结果显示：其检测结果与目前公认的高效液相色谱法检测结果比较有高度的相关性，由于其便捷、快速，适应于各级临床实验室使用，其广泛地应用于临床，必将促进我国各级医疗机构包括社区服务中心在内的糖化血红蛋白检测标准化检测的发展。
参考文献
[1] 周新，涂植光.临床生物化学和生物化学检验[M].3版.北京：人民卫生出版社，2006：89.
[2] Goodall I，Colman PG，Schneider HG，et al. Desirable performance standards for HbA（1c） analysis-precision，accuracy and standardization： consensus statement of the Australasian Association of Clinical Biochemists（ AACB） ，the Australian Diabetes Society（ADS） ，the Royal College of Pathologists of Australasia（RCPA），Endocrine Society of Australia（ESA），and the Australian Diabetes Educators Association（ ADEA） [J].Clin Chem Lab Med，2007，45（8） ：1083-1097.