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摘要：目的 建立滋阴明目片的质量标准。方法 采用薄层色谱法对滋阴明目片中的牡丹皮、山萸肉、羌活、石菖蒲进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对丹参中的丹酚酸B进行含量测定。色谱柱为Kromasil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-乙腈-1.67%甲酸水（24∶10∶66）为流动相，检测波长为286 nm，流速为1.0 mL/min，柱温：30 ℃。结果 在薄层色谱中可检出牡丹皮、山萸肉、羌活、石菖蒲的特征斑点，且斑点清晰，易于观察。丹酚酸B的进样量在0.32～1.92 μg范围内线性关系良好，r=0.999 9（n=5），平均加样回收率为99.91%，RSD=0.63%（n=6）。结论 该法专属性强，重复性好，结果准确，可用于滋阴明目片的质量控制。
关键词：滋阴明目片；质量标准；丹酚酸B；薄层色谱法；高效液相色谱法
滋阴明目方是湖南中医药大学第一附属医院眼科协定处方制剂，由山萸肉、熟地黄、黄精、牡丹皮等药材组成，具有滋阴、活血、利水的功效，临床用于原发性视网膜色素变性等眼疾疗效显著[1-2]。滋阴明目片是由滋阴明目丸改剂型而成，为控制滋阴明目片的质量，确保其临床疗效，本研究采用薄层色谱法对方中牡丹皮、山萸肉、羌活、石菖蒲进行定性鉴别，高效液相色谱法对方中丹参的主要成分丹酚酸B进行含量测定。
1 仪器与试药
Agilent 1100 Series 高效液相色谱系统（安捷伦科技有限公司），KQ-600型超声波清洗器（昆山市淀山湖检测仪器厂），AR2140电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）。
牡丹皮对照药材（批号121521-200504）、山萸肉对照药材（批号121528-200408）、羌活对照药材（批号121362-200407）、石菖蒲对照药材（批号121536- 200502）、丹酚酸B对照品（批号MUST-12020104），均由中国药品生物制品检定所提供。滋阴明目方药材（湖南中医药大学第一附属医院采购，批号20120615，经刘绍贵教授鉴定均符合药典标准）。乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 薄层色谱鉴别
2.1.1 牡丹皮 取本品样品6.0 g，研细，加无水乙醇超声提取（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，滤过，滤液挥干，加2 mL丙酮溶解作为供试品溶液。取不含牡丹皮的阴性样品6.0 g，同法制成阴性对照溶液。另取丹皮对照药材1.0 g，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]160，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20∶5∶0.5）为展开剂，展开，取出、晾干，喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液（1→10），于105 ℃烘箱加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置上显相同颜色橘黄色荧光斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。
2.1.2 山萸肉 取本品样品3.0 g，研细，加乙酸乙酯20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液挥干，残渣加2 mL无水乙醇溶解作为供试品溶液。取缺山萸肉的阴性样品3.0 g，同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g山萸肉对照药材，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]26，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。
2.1.3 羌活 取本品样品4.0 g，研细，加石油醚（60-90）30 mL回流提取30 min，滤过，滤液挥干，残渣加1 mL乙酸乙酯溶解作为供试品溶液。取缺羌活的阴性样品4.0 g，同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g羌活对照药材，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]170，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以正己烷-苯-乙酸乙酯（16∶8∶8）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，置365 nm紫外光灯下检视，供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。
2.1.4 石菖蒲 取取本品样品4.0 g，研细，加石油醚（60-90）30 mL回流提取30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL石油醚溶解作为供试品溶液。取缺石菖蒲的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g石菖蒲对照药材，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]85，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各5 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以石油醚（60-90）-乙酸乙酯（20∶5）为展开剂，展开、取出、晾干，放置1 h，置于365 nm紫外灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Kromasil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-1.67%甲酸溶液（24∶10∶66）；检测波长：286 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；理论塔板数按丹酚酸B峰计算不低于2000。
2.2.2 对照品溶液制备 称取经五氧化二磷干燥至恒重的丹酚酸B对照品适量，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶解，定容，制得每1 mL含丹酚酸B 0.16 mg的对照品溶液。 2.2.3 供试品溶液制备 取滋阴明目片3片，研细，取0.5 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇10 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷后定容至刻度，滤过，续滤液作为供试品溶液。
2.2.4 阴性对照溶液制备 取缺丹参的其余药味，按制备工艺要求制成不含丹参的阴性对照制剂，以供试品溶液制备的方法制备阴性对照溶液。
2.2.5 阴性干扰试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按上述色谱条件测定，结果在丹酚酸B色谱峰位置处无相应峰出现，表明方中其他药味对丹酚酸B的测定无干扰。色谱图见图2。
2.2.6 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液2、4、6、8、10、12 μL分别进样，测定峰面积。以峰面积值对进样量进行线性回归，得回归方程Y=1035.6X-20.733，r=0.999 9（n=6）。丹酚酸B进样量在0.32～1.92 μg范围内线性关系良好。
2.2.7 精密度试验 精密吸取供试品溶液在拟订的色谱条件下重复进样6次，结果峰面积的RSD=1.91%，表明仪器精密度良好。
2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于配置后0、1、2、4、8 h进样，测定丹酚酸B的峰面积，结果峰面积的RSD=1.36%，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。
2.2.9 重复性试验 取批号为20120816的样品，平行制备6份供试品溶液，并依法测定丹酚酸B的含量。结果丹酚酸B的平均含量为1.79 mg/g，RSD=1.24%，表明该方法重复性好。
2.2.10 加样回收率试验 精密称取6份批号为20120816的样品，分别加入丹酚酸B对照品适量，按“2.2.3”项下方法制备并测定，结果见表1。
3 讨论
滋阴明目片中丹参活血袪瘀，协助君药补肾养阴、益肝明目，共奏滋补肝肾、活血化瘀之功。丹酚酸B为丹参中的有效成分之一，因此，笔者以丹酚酸B的含量作为滋阴明目片的质量控制指标，参考有关文献[4-6]建立了HPLC测定本品中丹酚酸B含量的方法。
2010年版《中华人民共和国药典》（一部）中测丹参中丹酚酸B含量的流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59），在此流动相比例下丹酚酸B出峰时间过早，与其他峰不能很好分离，故将比例调整为甲醇-乙腈-1.67%甲酸溶液（24∶10∶66）；而且在试验中，比较了分别用60%、70%、80%的甲醇超声提取30 min或者加热回流1 h的样品处理方法，结果发现，加热回流1 h制备的供试品溶液中的丹酚酸B含量稍高于用超声提取30 min制备的供试品溶液，但差别不大，其中用80%的甲醇提取的浓度最高，考虑到超声提取方法简便、节能，故确定用80%的甲醇超声提取30 min。上述方法能将样品中的杂质与丹酚酸B分离开，且稳定可靠、准确，重复性好，可用于滋阴明目片的质量控制。
滋阴明目片中的山萸肉、羌活、石菖蒲药材均采用2010年版《中华人民共和国药典》的薄层色谱法鉴别，结果表明山萸肉、羌活、石菖蒲的阴性无干扰。牡丹皮的薄层鉴别则先采用药典方法，药材无斑点，后将制备过程中的乙醚提取换成乙醇提取，则能得到明显橘黄色斑点，阴性无干扰。以上4味药材的鉴别可作为滋阴明目片的质量标准。
参考文献：
[1] 艾明，孙明，李岱.视网膜色素变性的治疗进展[J].国际眼科杂志， 2010，10（7）：1324-1326.
[2] 何文安，张虎，代丽华，等.视网膜色素变性的研究进展[J].基层医学论坛，2008，12（35）：1132-1133.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.
[4] 蒋桂香，吕应年，范世锦，等.浓缩丹参骨宝颗粒中水溶性有效成分的质量控制研究[J].中国医药导报，2011，8（34）：67-69.
[5] 吕鹏，张振凌，杨锁成.HPLC测定复方丹参降浊丸中丹酚酸B的含量[J].中国中医药现代远程教育，2011，9（21）：134-135.
[6] 刘亚英，梁敏，杜艳玲，等.HPLC法同时测定注射用冠心宁中原儿茶醛、阿魏酸、丹酚酸B的含量[J].中国药师，2011，14（10）：1469-1471.
关键词：滋阴明目片；质量标准；丹酚酸B；薄层色谱法；高效液相色谱法
滋阴明目方是湖南中医药大学第一附属医院眼科协定处方制剂，由山萸肉、熟地黄、黄精、牡丹皮等药材组成，具有滋阴、活血、利水的功效，临床用于原发性视网膜色素变性等眼疾疗效显著[1-2]。滋阴明目片是由滋阴明目丸改剂型而成，为控制滋阴明目片的质量，确保其临床疗效，本研究采用薄层色谱法对方中牡丹皮、山萸肉、羌活、石菖蒲进行定性鉴别，高效液相色谱法对方中丹参的主要成分丹酚酸B进行含量测定。
1 仪器与试药
Agilent 1100 Series 高效液相色谱系统（安捷伦科技有限公司），KQ-600型超声波清洗器（昆山市淀山湖检测仪器厂），AR2140电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）。
牡丹皮对照药材（批号121521-200504）、山萸肉对照药材（批号121528-200408）、羌活对照药材（批号121362-200407）、石菖蒲对照药材（批号121536- 200502）、丹酚酸B对照品（批号MUST-12020104），均由中国药品生物制品检定所提供。滋阴明目方药材（湖南中医药大学第一附属医院采购，批号20120615，经刘绍贵教授鉴定均符合药典标准）。乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 薄层色谱鉴别
2.1.1 牡丹皮 取本品样品6.0 g，研细，加无水乙醇超声提取（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，滤过，滤液挥干，加2 mL丙酮溶解作为供试品溶液。取不含牡丹皮的阴性样品6.0 g，同法制成阴性对照溶液。另取丹皮对照药材1.0 g，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]160，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20∶5∶0.5）为展开剂，展开，取出、晾干，喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液（1→10），于105 ℃烘箱加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置上显相同颜色橘黄色荧光斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。
2.1.2 山萸肉 取本品样品3.0 g，研细，加乙酸乙酯20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液挥干，残渣加2 mL无水乙醇溶解作为供试品溶液。取缺山萸肉的阴性样品3.0 g，同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g山萸肉对照药材，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]26，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。
2.1.3 羌活 取本品样品4.0 g，研细，加石油醚（60-90）30 mL回流提取30 min，滤过，滤液挥干，残渣加1 mL乙酸乙酯溶解作为供试品溶液。取缺羌活的阴性样品4.0 g，同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g羌活对照药材，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]170，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以正己烷-苯-乙酸乙酯（16∶8∶8）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，置365 nm紫外光灯下检视，供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。
2.1.4 石菖蒲 取取本品样品4.0 g，研细，加石油醚（60-90）30 mL回流提取30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL石油醚溶解作为供试品溶液。取缺石菖蒲的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g石菖蒲对照药材，同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB薄层色谱法试验[3]85，吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各5 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以石油醚（60-90）-乙酸乙酯（20∶5）为展开剂，展开、取出、晾干，放置1 h，置于365 nm紫外灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液色谱则无此斑点。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Kromasil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-1.67%甲酸溶液（24∶10∶66）；检测波长：286 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；理论塔板数按丹酚酸B峰计算不低于2000。
2.2.2 对照品溶液制备 称取经五氧化二磷干燥至恒重的丹酚酸B对照品适量，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶解，定容，制得每1 mL含丹酚酸B 0.16 mg的对照品溶液。 2.2.3 供试品溶液制备 取滋阴明目片3片，研细，取0.5 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇10 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷后定容至刻度，滤过，续滤液作为供试品溶液。
2.2.4 阴性对照溶液制备 取缺丹参的其余药味，按制备工艺要求制成不含丹参的阴性对照制剂，以供试品溶液制备的方法制备阴性对照溶液。
2.2.5 阴性干扰试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按上述色谱条件测定，结果在丹酚酸B色谱峰位置处无相应峰出现，表明方中其他药味对丹酚酸B的测定无干扰。色谱图见图2。
2.2.6 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液2、4、6、8、10、12 μL分别进样，测定峰面积。以峰面积值对进样量进行线性回归，得回归方程Y=1035.6X-20.733，r=0.999 9（n=6）。丹酚酸B进样量在0.32～1.92 μg范围内线性关系良好。
2.2.7 精密度试验 精密吸取供试品溶液在拟订的色谱条件下重复进样6次，结果峰面积的RSD=1.91%，表明仪器精密度良好。
2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于配置后0、1、2、4、8 h进样，测定丹酚酸B的峰面积，结果峰面积的RSD=1.36%，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。
2.2.9 重复性试验 取批号为20120816的样品，平行制备6份供试品溶液，并依法测定丹酚酸B的含量。结果丹酚酸B的平均含量为1.79 mg/g，RSD=1.24%，表明该方法重复性好。
2.2.10 加样回收率试验 精密称取6份批号为20120816的样品，分别加入丹酚酸B对照品适量，按“2.2.3”项下方法制备并测定，结果见表1。
3 讨论
滋阴明目片中丹参活血袪瘀，协助君药补肾养阴、益肝明目，共奏滋补肝肾、活血化瘀之功。丹酚酸B为丹参中的有效成分之一，因此，笔者以丹酚酸B的含量作为滋阴明目片的质量控制指标，参考有关文献[4-6]建立了HPLC测定本品中丹酚酸B含量的方法。
2010年版《中华人民共和国药典》（一部）中测丹参中丹酚酸B含量的流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59），在此流动相比例下丹酚酸B出峰时间过早，与其他峰不能很好分离，故将比例调整为甲醇-乙腈-1.67%甲酸溶液（24∶10∶66）；而且在试验中，比较了分别用60%、70%、80%的甲醇超声提取30 min或者加热回流1 h的样品处理方法，结果发现，加热回流1 h制备的供试品溶液中的丹酚酸B含量稍高于用超声提取30 min制备的供试品溶液，但差别不大，其中用80%的甲醇提取的浓度最高，考虑到超声提取方法简便、节能，故确定用80%的甲醇超声提取30 min。上述方法能将样品中的杂质与丹酚酸B分离开，且稳定可靠、准确，重复性好，可用于滋阴明目片的质量控制。
滋阴明目片中的山萸肉、羌活、石菖蒲药材均采用2010年版《中华人民共和国药典》的薄层色谱法鉴别，结果表明山萸肉、羌活、石菖蒲的阴性无干扰。牡丹皮的薄层鉴别则先采用药典方法，药材无斑点，后将制备过程中的乙醚提取换成乙醇提取，则能得到明显橘黄色斑点，阴性无干扰。以上4味药材的鉴别可作为滋阴明目片的质量标准。
参考文献：
[1] 艾明，孙明，李岱.视网膜色素变性的治疗进展[J].国际眼科杂志， 2010，10（7）：1324-1326.
[2] 何文安，张虎，代丽华，等.视网膜色素变性的研究进展[J].基层医学论坛，2008，12（35）：1132-1133.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.
[4] 蒋桂香，吕应年，范世锦，等.浓缩丹参骨宝颗粒中水溶性有效成分的质量控制研究[J].中国医药导报，2011，8（34）：67-69.
[5] 吕鹏，张振凌，杨锁成.HPLC测定复方丹参降浊丸中丹酚酸B的含量[J].中国中医药现代远程教育，2011，9（21）：134-135.
[6] 刘亚英，梁敏，杜艳玲，等.HPLC法同时测定注射用冠心宁中原儿茶醛、阿魏酸、丹酚酸B的含量[J].中国药师，2011，14（10）：1469-1471.