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摘要：目的 考察不同提取工艺对秦皮总香豆素提取率及主要香豆素活性成分含量的影响，以确定其适宜的提取工艺。方法 采用正交设计法，以综合指标秦皮总香豆素提取率为考察指标，分别以水和醇作为溶剂，对秦皮提取工艺进行优选。结果 秦皮水提取最佳工艺：秦皮饮片加9倍量水，煎煮3次，每次煎煮1.5 h。水提取秦皮出膏率为28.87%，总香豆素含量为19.26%、提取率为5.56%，秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素总含量为13.47%。秦皮醇提取最佳工艺：秦皮饮片用8倍量75%乙醇回流2次，每次2 h。醇提取秦皮出膏率为30.47%，总香豆素含量为21.72%、提取率为6.62%，秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素总含量为15.29%。2种工艺对比，醇提取比水提取出膏率提高了5.54%，总香豆素含量提高了12.77%、提取率提高了19.06%，4种香豆素成分总含量提高了13.51%，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 醇提取工艺各考察指标均优于水提取工艺，故应采用75%乙醇提取秦皮总香豆素，且工艺稳定。
关键词：秦皮；提取工艺；总香豆素；提取率
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.10.024
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）10-0086-05
Abstract：Objective To study the effects of different extraction processes on extraction rate of cortex fraxini total coumarin and active constitute percentage of major coumarin；To establish a proper extraction process. Methods Orthogonal design method was applied to set comprehensive index cortex fraxini total coumarin extraction rate as inspecting index. Water and alcohol were used as solvent respectively to optimize the extraction process of cortex fraxini. Results Optimal water extraction process：cortex fraxini decoction pieces mixed with nine times of water， decocted for three times， 90 mins each time. The pasty fluid generating rate of cortex fraxini was 28.87%， total coumarin percentage was 19.26%， extraction rate was 5.56%， total percentage of Aesculin， Aesculetin， Fraxin， Fraxetin was 13.47%， when water was used as solvent. Optimal alcohol extraction process：cortex fraxini decoction pieces mixed with eight times of 75% ethyl alcohol， refluxed twice， two hours each time. The pasty fluid generating rate of cortex fraxini was 30.47%， total coumarin percentage was 21.72%， extraction rate was 6.62%， total percentage of Aesculin， Aesculetin， Fraxin， Fraxetin was 15.29%， when alcohol was used as solvent. It was found that using alcohol as solvent had a 5.54% higher pasty fluid generating rate， a 12.77% higher total coumarion percentage， a 19.06% higher total coumarin extraction rate， and a 13.51% higher percentage of total four coumarin constitutes than using water， with statistical significance. Conclusion Extraction process by using alcohol as solvent is better than using water. So the optimal and stable extraction process of cortex fraxini total coumarin is using 75% alcohol as solvent.
Key words：cortex fraxini；extraction process；total coumarin；extraction rate
秦皮产于我国东北、华北、华中、华西等地区[1-3]，有野生和栽培品种，资源相对充足，对于秦皮总香豆素的活性研究不断有新的发现，秦皮的开发利用大有潜力。秦皮的主要化学成分为香豆素，目前从秦皮中已分离得到近20种香豆素类成分[4-7]，秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素是秦皮药材的主要活性成分[8]。现代药理研究表明，秦皮总香豆素对急性痛风性关节炎大鼠、家兔具有抗炎作用[9-10]，可显著降低正常小鼠血尿酸及腹腔注射黄嘌呤造成的高尿酸小鼠血尿酸[10]。临床研究表明，秦皮总香豆素对原发性急性痛风性关节炎具有一定止痛效应[11]。目前，文献报道秦皮总香豆素提取方法主要有水煎煮、不同浓度乙醇回流和超声辅助提取[12-14]，但考察的指标或是采用紫外分光光度法测定总香豆素含量计算总香豆素提取率[13-14]，或是采用毛细管区带电泳法测定秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷含量计算提取率[12]，含测指标不同，造成2种工艺最终产品总香豆素含量、收率、提取率及主要有效成分含量没有可比性，无法判断哪种提取工艺更加合理。为此，本试验对秦皮水、醇提取工艺进行对比研究，以总香豆素提取率及4种主要香豆素成分总含量[15]为指标进行考察，对比评价秦皮不同提取工艺，为进一步开发利用秦皮提供参考依据。 1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国，安捷伦）， Agilent ZORBAX SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国，安捷伦），电子分析天平（CP2202S，瑞士，梅特勒-托利多），电子分析天平（SPS202F，奥豪斯公司），98-1-B电热套（天津泰斯特仪器有限公司），ZDHW调温电热套（北京中兴伟业仪器有限公司），HW·SY11-K数显恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司），CX-250超声波清洗机（天海双龙医疗设备有限公司），8453紫外-可见分光光度计（美国，安捷伦）。
秦皮饮片购于北京市本草方源药业有限公司，产地河北，经中国中医科学院中药研究所胡世林研究员鉴定为木犀科苦枥白蜡树Fraxinus rhynchophylla Hance的干燥枝皮。秦皮饮片含秦皮甲素3.49%、秦皮乙素0.04%，合计为3.53%，符合2010年版《中华人民共和国药典》规定；另外，秦皮饮片含秦皮苷1.61%、秦皮素0.09%。秦皮甲素、秦皮乙素对照品（批号分别为110741-200506、110740-200104）购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用；秦皮素（HPLC纯度>98%）、秦皮苷（HPLC纯度>98%）、秦皮提取物由中国中医科学院中医基础理论研究所中药分析室自制。乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为纯净水。
2 方法与结果
2.1 秦皮总香豆素含量测定
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取秦皮甲素对照品1.44 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为288 μg/mL的对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备 取秦皮醇提取物10 mg，精密称定，置锥形瓶中，精密加甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率200 Hz）30 min，取出放凉，再称定质量，加甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精密量取续滤液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.1.3 标准曲线绘制 精密量取秦皮甲素对照品溶液0.2、0.35、0.50、0.65、0.8 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。以甲醇为空白，按2010年版《中华人民共和国药典》（一部）分光光度法，在334 nm波长处测定吸光度，结果分别为0.211、0.365、0.531、0.686、0.857。以吸光度（A）值为纵坐标，秦皮甲素浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=0.037 3C-0.007 7，r=0.999 9 （n=5）。结果表明，秦皮甲素在5.76～23.04 μg/mL范围内与A值呈良好的线性关系。
2.1.4 总香豆素含量测定 按2010年版《中华人民共和国药典》（一部）分光光度法，在334 nm波长处测定吸光度，代入标准曲线，计算样品中总香豆素含量。
2.2 秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素含量测定
2.2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A（乙腈）-B（0.1%磷酸）梯度洗脱（0～21 min，8%A→15%A；21.0～21.1 min， 15%A→80%A；21.1～25 min，80%A），柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，检测波长334 nm。
2.2.2 对照品溶液的制备 取秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 mL含秦皮甲素197.90 μg、秦皮乙素10.80 μg、秦皮苷186.60 μg、秦皮素14.90 μg的混合对照品溶液，过0.45 ?m微孔滤膜，取续滤液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取秦皮提取物，粉碎，过80目筛，精密称取10 mg，置锥形瓶中，加甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率150 W，频率40 Hz） 30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，过滤，即得。
2.2.4 标准曲线绘制 精密吸取秦皮甲素对照品溶液（0.550 0 mg/mL）0.1、0.5、1.5、3、5、7 ?L，秦皮苷对照品溶液（0.539 0 mg/mL）0.1、0.5、1.5、3、5、7 ?L，秦皮乙素对照品溶液（0.060 0 mg/mL）1、3、5、7、9、11 ?L，秦皮素对照品溶液（0.056 2 mg/mL）1、3、5、7、9、11 ?L，按上述色谱条件测定。以峰面积为纵坐标、进样量为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。秦皮甲素Y=2111.7X+71.454，r=0.999 7，表明秦皮甲素在0.055 0～3.850 0 ?g范围内呈线性关系；秦皮苷Y=1563.5X-4.734 2，r=0.999 8，表明秦皮苷在0.053 9～3.773 0 ?g范围内呈线性关系；秦皮乙素Y=3313X+7.608，r=0.999 9，表明秦皮乙素在0.060 0～0.660 0 ?g范围内呈线性关系；秦皮素Y=3122.7X+13.715，r=0.999 9，表明秦皮素在0.056 2～0.618 2 ?g范围内呈线性关系。
2.2.5 样品含量测定 分别精密吸取秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下进行样品测定。
2.3 秦皮总香豆素水提取正交试验
取秦皮饮片200 g，以料液比、提取时间、提取次数作为考察因素，总香豆素提取率为考核指标，采用L9（34）正交设计，进行提取工艺的优选。总香豆素含量以秦皮甲素为对照品，采用紫外-可见分光光度法测定。秦皮总香豆素提取率（%）=提取物中总香豆素质量÷药材质量×100%=提取物出膏率（%）×提取物中总香豆素含量（%）。正交设计因素水平见表1，试验安排见表2，方差分析见表3。 方差分析表明，A因素对提取结果有极显著影响，C因素对提取结果有显著影响，B因素对提取结果没有影响。根据方差分析结果和极差判断，秦皮水提取最佳工艺为A3B2C3，即秦皮饮片加9倍量水，煎煮3次，每次1.5 h。
2.4 秦皮总香豆素醇提取正交试验
取秦皮饮片100 g，对可能影响秦皮总香豆素提取的因素乙醇体积分数、药材与乙醇比例、回流时间、回流次数作为考查因素，以总香豆素提取率为考核指标，采用L9（34）正交设计，进行总香豆素醇提取工艺优选。总香豆素含量以秦皮甲素为对照品，采用紫外-可见分光光度法测定。因素水平见表4，试验安排见表5，方差分析见表6。
方差分析表明，各因素对试验结果均没有显著影响。极差分析显示，各因素对考核指标的影响顺序是D>A>C>B，综合考虑，各因素选取的水平为A2B2C2D2，即秦皮醇提取最佳提取工艺为秦皮饮片采用8倍量75%乙醇回流2次，每次回流2 h。
2.5 水提取工艺验证试验
取秦皮药材3份，每份100 g，按优选工艺平行试验，计算提取物出膏率、总香豆素提取率，测定总香豆素及秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素含量，结果见表7，表明水提取工艺稳定。
2.6 醇提取工艺验证试验
取秦皮药材3份，每份100 g，按优选工艺平行试验，计算样品出膏率和总香豆素提取率。测定总香豆素及秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷含量，结果见表8，表明醇提取工艺稳定。
2.7 2种提取方法考核指标比较
对上述2种提取方法的考察指标分别进行独立样本t检验，均P<0.05，说明2种提取方法对出膏率、总香豆素含量、总香豆素提取率、4种香豆素总含量的影响有统计学意义，结果见表9。
3 讨论
本研究除对提取物中总香豆素含量进行检测外，还对4种主要香豆素活性成分（秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素）含量进行了检测。原因是紫外-可见分光光度法是通过测定被测物质（为一类物质或有相同发光基团的物质）在特定波长处的吸光度对该物质进行定量，该方法不能排除在该波长下其他吸光物质对被测物质吸光度的干扰吸收。秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素是秦皮中主要香豆素成分，其含量采用高效液相色谱法测定，真实可信。所以，在2种工艺对比中，除秦皮总香豆素含量外，还考察了这4种成分总含量。结果显示，总香豆素含量与这4种成分总含量的变化趋势一致。
秦皮总香豆素提取率与提取物的质和量有直接关系，是考核秦皮提取工艺的综合指标，它是综合评价提取物收率和质量的指标，采用该指标可避免单纯考核提取物收率或提取物含量一个指标带来的偏颇。从考察结果可知，醇提取比水提取总香豆素提取率提高了19.06%，出膏率提高了5.54%，总香豆素含量提高了12.77%，4种香豆素成分总含量提高了13.51%。经t检验，2种提取方法有显著区别，从收率和质量方面可以明确醇提取秦皮总香豆素工艺比水提取更优。
此外，还要从生产成本角度进行对比分析。第一，从生产周期分析，醇提取4 h，水提取4.5 h，醇提比水提节省时间12.5%，既可提高生产效率，又可减少人员投入成本；第二，从提取溶剂成本分析，1 kg秦皮醇提取（提取2次）用75%乙醇16 L，需要95%乙醇约12 L，水提取需要去离子水27 L，且75%乙醇16 L可回收得到80%乙醇约10 L（通常回收率在65%左右，折合成95%乙醇为8.8 L，再投入时仅需95%乙醇3.2 L，小于水提取成本。在产业化生产中均采用循环使用医用乙醇方式，随着提取次数增加，成本会逐渐降低，所以，采用75%乙醇提取秦皮的成本并不比采用水提取成本高；第三，从消耗能源成本考虑，水提取时间比醇提取时间长0.5 h，消耗电量多。
综上所述，从产品的收率和质量考虑，采用75%乙醇提取秦皮总香豆素比采用水提取更合理；从生产投入成本（生产周期、能源消耗、人员投入）总体考虑，醇提取工艺比水提取工艺有优势。综合考虑上述两大方面因素，秦皮产业化生产采用75%乙醇提取工艺比采用水提取工艺的投入产出比更有优势。
参考文献：
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[14] 熊利芝，马青，龙华.秦皮总香豆素超声辅助提取工艺优化[J].中药材，2012，35（4）：634-637.
[15] 叶迎，柏冬，包强，等.秦皮提取物含量测定方法的研究[J].中国中医药信息杂志，2015，22（8）：83-87.
（收稿日期：2014-11-13）
（修回日期：2015-02-06；编辑：陈静）
关键词：秦皮；提取工艺；总香豆素；提取率
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.10.024
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）10-0086-05
Abstract：Objective To study the effects of different extraction processes on extraction rate of cortex fraxini total coumarin and active constitute percentage of major coumarin；To establish a proper extraction process. Methods Orthogonal design method was applied to set comprehensive index cortex fraxini total coumarin extraction rate as inspecting index. Water and alcohol were used as solvent respectively to optimize the extraction process of cortex fraxini. Results Optimal water extraction process：cortex fraxini decoction pieces mixed with nine times of water， decocted for three times， 90 mins each time. The pasty fluid generating rate of cortex fraxini was 28.87%， total coumarin percentage was 19.26%， extraction rate was 5.56%， total percentage of Aesculin， Aesculetin， Fraxin， Fraxetin was 13.47%， when water was used as solvent. Optimal alcohol extraction process：cortex fraxini decoction pieces mixed with eight times of 75% ethyl alcohol， refluxed twice， two hours each time. The pasty fluid generating rate of cortex fraxini was 30.47%， total coumarin percentage was 21.72%， extraction rate was 6.62%， total percentage of Aesculin， Aesculetin， Fraxin， Fraxetin was 15.29%， when alcohol was used as solvent. It was found that using alcohol as solvent had a 5.54% higher pasty fluid generating rate， a 12.77% higher total coumarion percentage， a 19.06% higher total coumarin extraction rate， and a 13.51% higher percentage of total four coumarin constitutes than using water， with statistical significance. Conclusion Extraction process by using alcohol as solvent is better than using water. So the optimal and stable extraction process of cortex fraxini total coumarin is using 75% alcohol as solvent.
Key words：cortex fraxini；extraction process；total coumarin；extraction rate
秦皮产于我国东北、华北、华中、华西等地区[1-3]，有野生和栽培品种，资源相对充足，对于秦皮总香豆素的活性研究不断有新的发现，秦皮的开发利用大有潜力。秦皮的主要化学成分为香豆素，目前从秦皮中已分离得到近20种香豆素类成分[4-7]，秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素是秦皮药材的主要活性成分[8]。现代药理研究表明，秦皮总香豆素对急性痛风性关节炎大鼠、家兔具有抗炎作用[9-10]，可显著降低正常小鼠血尿酸及腹腔注射黄嘌呤造成的高尿酸小鼠血尿酸[10]。临床研究表明，秦皮总香豆素对原发性急性痛风性关节炎具有一定止痛效应[11]。目前，文献报道秦皮总香豆素提取方法主要有水煎煮、不同浓度乙醇回流和超声辅助提取[12-14]，但考察的指标或是采用紫外分光光度法测定总香豆素含量计算总香豆素提取率[13-14]，或是采用毛细管区带电泳法测定秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷含量计算提取率[12]，含测指标不同，造成2种工艺最终产品总香豆素含量、收率、提取率及主要有效成分含量没有可比性，无法判断哪种提取工艺更加合理。为此，本试验对秦皮水、醇提取工艺进行对比研究，以总香豆素提取率及4种主要香豆素成分总含量[15]为指标进行考察，对比评价秦皮不同提取工艺，为进一步开发利用秦皮提供参考依据。 1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国，安捷伦）， Agilent ZORBAX SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国，安捷伦），电子分析天平（CP2202S，瑞士，梅特勒-托利多），电子分析天平（SPS202F，奥豪斯公司），98-1-B电热套（天津泰斯特仪器有限公司），ZDHW调温电热套（北京中兴伟业仪器有限公司），HW·SY11-K数显恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司），CX-250超声波清洗机（天海双龙医疗设备有限公司），8453紫外-可见分光光度计（美国，安捷伦）。
秦皮饮片购于北京市本草方源药业有限公司，产地河北，经中国中医科学院中药研究所胡世林研究员鉴定为木犀科苦枥白蜡树Fraxinus rhynchophylla Hance的干燥枝皮。秦皮饮片含秦皮甲素3.49%、秦皮乙素0.04%，合计为3.53%，符合2010年版《中华人民共和国药典》规定；另外，秦皮饮片含秦皮苷1.61%、秦皮素0.09%。秦皮甲素、秦皮乙素对照品（批号分别为110741-200506、110740-200104）购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用；秦皮素（HPLC纯度>98%）、秦皮苷（HPLC纯度>98%）、秦皮提取物由中国中医科学院中医基础理论研究所中药分析室自制。乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为纯净水。
2 方法与结果
2.1 秦皮总香豆素含量测定
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取秦皮甲素对照品1.44 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为288 μg/mL的对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备 取秦皮醇提取物10 mg，精密称定，置锥形瓶中，精密加甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率200 Hz）30 min，取出放凉，再称定质量，加甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精密量取续滤液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.1.3 标准曲线绘制 精密量取秦皮甲素对照品溶液0.2、0.35、0.50、0.65、0.8 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。以甲醇为空白，按2010年版《中华人民共和国药典》（一部）分光光度法，在334 nm波长处测定吸光度，结果分别为0.211、0.365、0.531、0.686、0.857。以吸光度（A）值为纵坐标，秦皮甲素浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=0.037 3C-0.007 7，r=0.999 9 （n=5）。结果表明，秦皮甲素在5.76～23.04 μg/mL范围内与A值呈良好的线性关系。
2.1.4 总香豆素含量测定 按2010年版《中华人民共和国药典》（一部）分光光度法，在334 nm波长处测定吸光度，代入标准曲线，计算样品中总香豆素含量。
2.2 秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素含量测定
2.2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A（乙腈）-B（0.1%磷酸）梯度洗脱（0～21 min，8%A→15%A；21.0～21.1 min， 15%A→80%A；21.1～25 min，80%A），柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，检测波长334 nm。
2.2.2 对照品溶液的制备 取秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 mL含秦皮甲素197.90 μg、秦皮乙素10.80 μg、秦皮苷186.60 μg、秦皮素14.90 μg的混合对照品溶液，过0.45 ?m微孔滤膜，取续滤液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取秦皮提取物，粉碎，过80目筛，精密称取10 mg，置锥形瓶中，加甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率150 W，频率40 Hz） 30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，过滤，即得。
2.2.4 标准曲线绘制 精密吸取秦皮甲素对照品溶液（0.550 0 mg/mL）0.1、0.5、1.5、3、5、7 ?L，秦皮苷对照品溶液（0.539 0 mg/mL）0.1、0.5、1.5、3、5、7 ?L，秦皮乙素对照品溶液（0.060 0 mg/mL）1、3、5、7、9、11 ?L，秦皮素对照品溶液（0.056 2 mg/mL）1、3、5、7、9、11 ?L，按上述色谱条件测定。以峰面积为纵坐标、进样量为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。秦皮甲素Y=2111.7X+71.454，r=0.999 7，表明秦皮甲素在0.055 0～3.850 0 ?g范围内呈线性关系；秦皮苷Y=1563.5X-4.734 2，r=0.999 8，表明秦皮苷在0.053 9～3.773 0 ?g范围内呈线性关系；秦皮乙素Y=3313X+7.608，r=0.999 9，表明秦皮乙素在0.060 0～0.660 0 ?g范围内呈线性关系；秦皮素Y=3122.7X+13.715，r=0.999 9，表明秦皮素在0.056 2～0.618 2 ?g范围内呈线性关系。
2.2.5 样品含量测定 分别精密吸取秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下进行样品测定。
2.3 秦皮总香豆素水提取正交试验
取秦皮饮片200 g，以料液比、提取时间、提取次数作为考察因素，总香豆素提取率为考核指标，采用L9（34）正交设计，进行提取工艺的优选。总香豆素含量以秦皮甲素为对照品，采用紫外-可见分光光度法测定。秦皮总香豆素提取率（%）=提取物中总香豆素质量÷药材质量×100%=提取物出膏率（%）×提取物中总香豆素含量（%）。正交设计因素水平见表1，试验安排见表2，方差分析见表3。 方差分析表明，A因素对提取结果有极显著影响，C因素对提取结果有显著影响，B因素对提取结果没有影响。根据方差分析结果和极差判断，秦皮水提取最佳工艺为A3B2C3，即秦皮饮片加9倍量水，煎煮3次，每次1.5 h。
2.4 秦皮总香豆素醇提取正交试验
取秦皮饮片100 g，对可能影响秦皮总香豆素提取的因素乙醇体积分数、药材与乙醇比例、回流时间、回流次数作为考查因素，以总香豆素提取率为考核指标，采用L9（34）正交设计，进行总香豆素醇提取工艺优选。总香豆素含量以秦皮甲素为对照品，采用紫外-可见分光光度法测定。因素水平见表4，试验安排见表5，方差分析见表6。
方差分析表明，各因素对试验结果均没有显著影响。极差分析显示，各因素对考核指标的影响顺序是D>A>C>B，综合考虑，各因素选取的水平为A2B2C2D2，即秦皮醇提取最佳提取工艺为秦皮饮片采用8倍量75%乙醇回流2次，每次回流2 h。
2.5 水提取工艺验证试验
取秦皮药材3份，每份100 g，按优选工艺平行试验，计算提取物出膏率、总香豆素提取率，测定总香豆素及秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素含量，结果见表7，表明水提取工艺稳定。
2.6 醇提取工艺验证试验
取秦皮药材3份，每份100 g，按优选工艺平行试验，计算样品出膏率和总香豆素提取率。测定总香豆素及秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、秦皮苷含量，结果见表8，表明醇提取工艺稳定。
2.7 2种提取方法考核指标比较
对上述2种提取方法的考察指标分别进行独立样本t检验，均P<0.05，说明2种提取方法对出膏率、总香豆素含量、总香豆素提取率、4种香豆素总含量的影响有统计学意义，结果见表9。
3 讨论
本研究除对提取物中总香豆素含量进行检测外，还对4种主要香豆素活性成分（秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素）含量进行了检测。原因是紫外-可见分光光度法是通过测定被测物质（为一类物质或有相同发光基团的物质）在特定波长处的吸光度对该物质进行定量，该方法不能排除在该波长下其他吸光物质对被测物质吸光度的干扰吸收。秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素是秦皮中主要香豆素成分，其含量采用高效液相色谱法测定，真实可信。所以，在2种工艺对比中，除秦皮总香豆素含量外，还考察了这4种成分总含量。结果显示，总香豆素含量与这4种成分总含量的变化趋势一致。
秦皮总香豆素提取率与提取物的质和量有直接关系，是考核秦皮提取工艺的综合指标，它是综合评价提取物收率和质量的指标，采用该指标可避免单纯考核提取物收率或提取物含量一个指标带来的偏颇。从考察结果可知，醇提取比水提取总香豆素提取率提高了19.06%，出膏率提高了5.54%，总香豆素含量提高了12.77%，4种香豆素成分总含量提高了13.51%。经t检验，2种提取方法有显著区别，从收率和质量方面可以明确醇提取秦皮总香豆素工艺比水提取更优。
此外，还要从生产成本角度进行对比分析。第一，从生产周期分析，醇提取4 h，水提取4.5 h，醇提比水提节省时间12.5%，既可提高生产效率，又可减少人员投入成本；第二，从提取溶剂成本分析，1 kg秦皮醇提取（提取2次）用75%乙醇16 L，需要95%乙醇约12 L，水提取需要去离子水27 L，且75%乙醇16 L可回收得到80%乙醇约10 L（通常回收率在65%左右，折合成95%乙醇为8.8 L，再投入时仅需95%乙醇3.2 L，小于水提取成本。在产业化生产中均采用循环使用医用乙醇方式，随着提取次数增加，成本会逐渐降低，所以，采用75%乙醇提取秦皮的成本并不比采用水提取成本高；第三，从消耗能源成本考虑，水提取时间比醇提取时间长0.5 h，消耗电量多。
综上所述，从产品的收率和质量考虑，采用75%乙醇提取秦皮总香豆素比采用水提取更合理；从生产投入成本（生产周期、能源消耗、人员投入）总体考虑，醇提取工艺比水提取工艺有优势。综合考虑上述两大方面因素，秦皮产业化生产采用75%乙醇提取工艺比采用水提取工艺的投入产出比更有优势。
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（收稿日期：2014-11-13）
（修回日期：2015-02-06；编辑：陈静）