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革兰氏阴性菌已经进化出多种蛋白质分泌系统，以输出或输入跨膜大分子来适应环境和存活。2006年，Ⅵ型分泌系统(TypeⅥSecretion System，T6SS)首次在铜绿假单胞菌和霍乱弧菌中作为新型的细菌蛋白分泌系统被定义，并证明其与致病性有关且介导致病菌与宿主的相互作用。T6SS广泛存在于约四分之一的革兰氏阴性菌中，是一种多功能的注射装置，可以将效应分子传递至环境、真核宿主和原核竞争者。T6SS由跨膜复合物和类似噬菌体尾鞘的针管状结构组成。关于T6SS的结构研究中，普遍认为Hcp是T6SS的关键结构组分，以头对头或头对尾的方式聚合形成环状六聚体从而形成T6SS的内管道，在鞘收缩时推动T6SS靶向细胞以输送效应蛋白。作为T6SS结构重要组成部分的同时，Hcp的分泌作为T6SS发挥功能的标志。 有关细菌分泌系统的结构和机制研究已取得重大进展。近年来，关于分泌系统在宿主一致病菌的互作中尤其是关于免疫应答的复杂作用己成为研究热点。细菌分泌系统传送效应分子来干扰宿主细胞的正常生理功能，以一定的方式影响炎性小体通路。本研究中，PCN033是分离于病猪的肠外致病性大肠杆菌，通过全基因组测序发现其含一套T6SS基因簇。如其他致病性大肠杆菌一样，PCN033的基因组中有3个hcp拷贝，其中两个位于T6SS基因簇内，另一个位于T6SS基因簇外，分别命名为hcp1、hcp2、hcp3。本实验室已构建了并保存了Δhcp1Δhcp2Δhcp3缺失株，hcp作为T6SS发挥功能的标志，缺失hcp后，T6SS无法正常组装进而发挥作用，故本研究利用PCN033、Δhcp1Δhcp2Δhcp3两个菌株，对PCN033感染后的宿主应答及T6SS在激活炎症过程中发挥的作用进行了探究，主要内容如下: 1.RNA-seq检测PCN033感染后RAW264.7的转录组变化 选择小鼠巨噬细胞RAW264.7为PCN033的宿主细胞模型，对感染PCN033后宿主细胞RAW264.7内发生的转录组变化进行分析，发现了508个差异表达的基因，对差异基因进行功能分析，发现在GO数据库中，与之相关且有统计学意义的涉及2052项生物过程、133种细胞组分、211个分子功能及52种KEGG代谢通路。差异基因参与的KEGG代谢通路中与天然免疫相关的有NF-κB、TNF、Apoptosis、TLR、NLR等信号通路。 2.PCN033激活NF-κB信号通路和NLRP3、NLRC4炎性小体 通过Western-blot检测PCN033感染后RAW264.7中NF-κB信号通路的激活情况和胞内蛋白NLRP3、NLRC4、ASC的表达情况。结果表明，随着感染时间增加，p65发生磷酸化、IκBα降解，NLRP3、NLRC4及ASC的表达均明显上调。这说明，PCN033感染后激活NF-κB信号通路和NLRP3、NLRC4炎性小体。 3.T6SS在PCN033与宿主互作过程中的作用 有文献报道T6SS能够促进小鼠巨噬细胞的细胞毒性作用。对细胞培养液中的LDH进行检测，发现Δhcp1Δhcp2Δhcp3感染相对于PCN033感染后的细胞毒性显著降低，表明了T6SS对小鼠巨噬细胞的细胞毒性作用有促进作用。PCN033、Δhcp1Δhcp2Δhcp3以同样的剂量静脉注射小鼠后，通过ELISA测定小鼠血清中的IL-1β。发现相对于野毒株PCN033，缺失hcp后感染使得小鼠产生IL-1β的能力减弱，也就是说T6SS以一定的方式参与PCN033促进IL-1β的释放。进一步，我们对炎性因子的转录水平进行qRT-PCR检测，发现T6SS对促炎因子IL-1β、IL-18、CXCL3、TNF-α的表达有上调作用，说明T6SS确实有一定的促炎作用。经Western-blot检测，发现PCN033感染促进RAW264.7中caspase1的活化及pro-IL-1β的加工，且T6SS在此过程中发挥作用。另外我们发现T6SS参与PCN033感染激活宿主的NF-κB信号通路和NLRP3、NLRC4炎性小体。