妊娠滋养细胞疾病是一组来源于胎盘绒毛滋养细胞的疾病。恶性滋养细胞肿瘤包括侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌，该病具有高度恶性，早期可通过血行转移至全身，破坏组织和器官，引起出血、坏死。因而早期定位诊断恶性滋养细胞肿瘤尤为重要。 二维超声及多普勒扫描技术揭示恶性滋养细胞疾病的存在是间接性的，通过超声观察滋养细胞肿瘤侵袭后的形态学变化推断滋养细胞侵蚀性病灶的有无。 近年来，超声微泡造影剂的应用提高了肿瘤血管的超声显像，通过静脉注入超声造影剂后，微泡进入血管，极大增强了血管内的回声，使肿瘤细微血管的显示提高。由于普通的微泡造影剂缺乏对病变组织的特殊亲和力，不能有效驻留靶组织，只能在短暂的动脉相中使靶器官血管显影，无特异性，不利于观察微小病变，因而难以早期发现滋养细胞侵袭血管的病灶。 目前，有学者提出了靶向超声造影剂(Targeted Microbubble Contrast Agents，TMCA)的概念。其定义是指将特异性配体连接到微泡造影剂表面，使之到达靶目标进行超声显影的过程。这种靶向微泡对于靶区病变有较好的亲和力，可以达到靶向区域组织或器官，选择性的与相应的配体结合。当非特异性造影剂信号在循环背景中消失后，靶向微泡仍然可以增强靶区超声影像，从而达到特异性的增强靶区超声信号的作用，为滋养细胞肿瘤的早期诊断及局部靶向注射奠定基础。 恶性滋养细胞具有生长活跃和侵蚀母体组织的特点，并都能取代血管内皮细胞而形成血管内皮层，从而使滋养细胞极易侵入母体血液中去。此外，肿瘤的滋养细胞和正常妊娠的滋养细胞具有相似之处，都能产生绒毛膜促性腺激素(HCG)等糖蛋白和性激素，HCG是滋养细胞肿瘤理想的肿瘤标记物，而β—亚单位结构为HCG所特有。本研究的目的就是制备耦合抗HCG抗体的靶向性微泡造影剂，研究抗体与微泡在体外的结合特性，以及靶向微泡与妊娠绒毛组织切片的结合特性，从而为今后滋养细胞肿瘤的早期诊断，准确定位滋养细胞的发生部位，观察滋养细胞侵蚀子宫肌壁的范围和程度，以及评估化疗疗效提供更为准确和科学的依据。 研究目的： 1、制备耦合抗β—hCG抗体的靶向微泡造影剂，观察微泡与抗体的结合率随时间变化情况，探讨微泡与抗体结合的强度； 2、探讨妊娠绒毛组织表面及间隙的β—hCG抗原与靶向微泡造影剂的结合特性。 研究内容及方法： 标本采集、保存及处理 将每次在人流室获取的新鲜妊娠绒毛组织，立即送我院病理科，做快速冰冻切片，切片后用锡纸包裹，立即保存于—29℃冰箱中，当日使用完毕。将每次在开腹或阴式全宫切除术获取的子宫内膜组织，肉眼观察内膜组织大致正常，立即送病理科做快速冰冻切片，保存和处理方法同绒毛组织。 实验分组 按不同的标本和不同的造影剂共设4个研究组。将妊娠绒毛组织切片随机分为A组(与靶向微泡造影剂进行结合试验)和B组(与SonoVue混悬液进行结合试验)，每组各10张切片；将正常子宫内膜组织切片随机分为C组(与靶向微泡造影剂进行结合试验)和D组(与Sono Vue混悬液进行结合试验)，每组各10张切片。 靶向微泡造影剂的制备 参考文献方法进行，从—30℃冰箱中取出已经分装好的Mouse Anti—hCG—beta抗体稀释液，抽取10μl，用新配制的PBS缓冲液以1：500倍稀释，振荡1分钟充分混匀。取5ml的SonoVue混悬液和等体积的Mouse Anti—hCG—beta抗体稀释液，室温下充分混匀，调整PH值在7.2～7.4，用振荡器振荡20秒，然后于4℃条件下静置2h，待其分层，取上层混悬液，加入PBS液重悬洗涤，去除游离抗体，抽取上层白色混悬液，弃下清液。洗涤后的微泡静置于4℃冰箱中密闭保存，使用不超过6小时。 靶向微泡造影剂的鉴定 ①玻片凝集实验：取洁净载玻片，分别滴加20μl靶向微泡造影剂及SonoVue混悬液。然后在载玻片上分别滴加等体积兔抗鼠IgG血清和等体积生理盐水。不时摇动，光镜下观察。 ②免疫荧光实验：取上述制备的靶向微泡造影剂和SonoVue混悬液各50μl，分别加入等体积FITC标记的兔抗小鼠IgG抗体稀释液，避光反应15分钟，在荧光显微镜下观察。 ③流式细胞仪检测：取上述制备好的靶向微泡造影剂2ml与等体积FITC标记兔抗鼠IgG抗体稀释液混匀，避光反应10分钟，去除游离抗体。用500μl靶向微泡造影剂+500μlPBS作为空白对照组。在流式细胞仪器上进行检测，分别检测1分钟，10分钟，20分钟，30分钟各时间点，SonoVue微泡和抗HCG抗体的结合率。 靶向微泡造影剂与妊娠绒毛组织切片的靶向结合试验 1.靶向微泡造影剂组与普通SonoVue混悬液对照组试验：取空白洁净载玻片，分别滴加靶向微泡造影剂和SonoVue混悬液各100μl，然后平放在37℃恒温水浴槽中的培养皿中，将绒毛组织切片上附着有组织物的一面朝下轻轻覆盖在滴加造影剂的空白载玻片上，孵育5分钟后，在显微镜下观察微泡与绒毛组织结合情况，每张切片均观察6个不同的绒毛组织，以每个绒毛组织切面周围全部有微泡聚集为阳性，共计数60个不同的绒毛组织；以子宫内膜组织为对照组。 2.观察5分钟后，用新配制的PBS液冲洗绒毛组织切片上的靶向微泡造影剂3次，然后在显微镜下观察微泡与绒毛组织结合情况，以子宫内膜组织为对照组。 3.抗体阻断试验：取绒毛组织切片，复温20分钟，PBS液冲洗3次后，在切片上滴加100μl Mouse Anti—hCG—beta稀释液，37℃孵育5分钟，用PBS液冲洗去除未结合的游离抗体，再加入靶向微泡造影剂100μl，37℃孵育5分钟，用PBS液洗涤后，计数绒毛组织与靶向微泡造影剂的结合情况，以子宫内膜组织为对照。 统计学处理 采用SPSS13.0软件分析，所有数据用均数士标准差(-x±S)表示，根据资料性质采用方差分析及列联表分析方法进行分析，两组之间的比较用LSD法，P<0.05认为差异有显著性。 研究结果： 1靶向微泡造影剂的鉴定结果 1.1本实验中所制备的靶向微泡造影剂悬浮后光镜下观察，微泡大小、分布均匀，与普通微泡无异。当加入兔抗鼠IgG抗血清后，光镜下观察原来均匀分布的靶向微泡造影剂形成轻度凝集状态。而加生理盐水后仍是均匀分散的微气泡。SonoVue加入兔抗鼠IgG抗血清或生理盐水后均未见凝集反应。 2.2经FITC标记的兔抗小鼠IgG抗体稀释液染色后，荧光显微镜下观察可见靶向微泡造影剂壳表面发出环状明亮的的绿色荧光，而单纯的SonoVue微泡表面则未见荧光。 3.3流式细胞仪检测结果显示：SonoVue微泡与Mouse Anti—hCG—beta的结合率1min、10min、20min、30min分别为(92.25±2.18)％、(93.59±4.46)％、(95.27±2.88)％、(95.80±1.5)％。1min时的结合率分别和20min与30min的差别有显著性意义(P<0.05)，10min和30min的差别有显著性意义(P<0.05)，而其余几个时间点的差别没有显著性意义。 2靶向微泡造影剂与妊娠绒毛组织特异性结合试验 2.1靶向微泡造影剂与妊娠绒毛组织孵育5分钟后，在光镜下观察可见大量靶向微泡造影剂聚集在绒毛滋养层细胞周围，只有少量的SonoVue微泡结合在绒毛组织周围；而对照组子宫内膜组织上只有少量的靶向微泡造影剂或SonoVue微泡散在的结合于组织间隙。TMCA与绒毛组织和子宫内膜组织结合的阳性率分别为83.3％和13.3％，两组之间结果比较有显著性差别(P<0.01)；SonoVue与绒毛组织和子宫内膜组织结合率分别为15％和8.3％，两组之间结果比较无显著性差异(P>0.05)；TMCA与绒毛组织结合率和SonoVue与绒毛组织结合率比较结果有显著性差别(P<0.01)；TMCA和内膜组织结合率与SonoVue和内膜组织结合率比较结果无显著性差别(P>0.05)。 2.2靶向微泡造影剂与不同组织冲洗前后的结合率：靶向微泡造影剂与绒毛组织反应5分钟后，显微镜下观察到微泡大部分聚集在绒毛滋养层细胞周围，而组织切片的中间胚芽组织部分少见微泡聚集。冲洗之前结合率为83.3％，用PBS液匀速冲洗3次之后，有部分微泡被冲走，冲洗之后结合率为78.3％，冲洗前后结合率比较结果无显著性差异(P>0.05)；对照组子宫内膜组冲洗前后的结合率分别为13.3％和5.0％，冲洗前后结合率比较结果无显著性差异(P>0.05)。 2.3当使用抗HCG抗体预处理绒毛组织和子宫内膜组织后，TMCA与绒毛组织的结合率为16.7％，TMCA与内膜组织的结合率为11.7％；抗体预处理绒毛组织前后结合率比较结果有显著性差异(P<0.01)，抗体预处理内膜组织前后结合率比较结果无显著性差异(P>0.05)。 结论： 1、用交联法成功制备了能与妊娠绒毛组织靶向结合的靶向微泡造影剂，此方法操作简单，不仅不会对微泡造成破坏，还保持了靶向微泡造影剂的免疫活性； 2、本研究中，微泡与抗体的结合率随时间变化没有明显下降，提示抗体与微泡的结合时间足以满足临床检查操作需要； 3、靶向微泡造影剂与妊娠绒毛组织在体外一定条件下能够特异性结合，且具有一定强度。