豆酱是一种传统的发酵大豆食品,在亚洲国家被广泛用作调味品已有数千年之久。具有丰富的营养和馥郁的香气,作为蛋白质来源和调味品深受老百姓喜爱。豆酱在发酵过程中,微生物代谢分泌的各类酶通过复杂的生化反应可实现对淀粉、蛋白质和糖类等大分子的降解,从而影响着豆酱的品质和风味。理解传统豆酱发酵过程中微生物群及其功能调控,是实现传统产业技术提升的重要基础。因此,为了探究豆酱发酵过程中的微生物群落结构和代谢调节分子机制,本研究利用宏蛋白质组学及代谢组学联合现代分子生物学手段,鉴定了沈阳市及周边农家和工厂豆酱微生物蛋白的相对变化及表达谱,研究了不同发酵阶段和不同发酵工艺豆酱的微生物群落结构差异、微生物功能本质及关键功能酶系。1.以沈阳市周边三户农家的12份自然发酵酱醅(0天,20天,40天,60天)为研究对象,首次利用宏基因组结果作为数据库成功地将宏蛋白质组学的方法应用在酱醅的分析当中,为后续实验提供研究基础。结果表明:调控酱醅自然发酵的基因中,细菌的丰度高于真菌。而宏蛋白质结果表明真菌为优势菌,远高于在宏基因预测的比例,参与微生物生物过程的酶系,主要也来源于酱醅中真菌的分泌,这可能与微生物基因的选择性表达有关。共鉴定得到7785种微生物蛋白,通过PCA主成分和聚类分析可知不同农家制作的酱醅微生物蛋白来源差异较明显;整个发酵过程来自地丝菌属、根霉属、青霉属的蛋白占主要部分,发酵中后期来自细菌,如乳酸杆菌、明串珠菌的蛋白数量增多,随发酵时间的延长蛋白数量逐渐增加。通过COG功能检索分析,发现这些差异蛋白质主要参与碳水化合物的运输与代谢、能量的生产和转化、蛋白质翻译和核糖体结构,KEGG注释发现代谢途径主要参与碳水化合物、能量以及氨基酸的代谢,蛋白质翻译,信号转导也占重要部分。2.以沈阳市周边三户农家的9份自然发酵豆酱(14天,28天,42天)为研究对象,共鉴定得到3493种微生物蛋白,在门水平上主要来自厚壁菌门和担子菌门。在属水平上主要来自芽孢杆菌属、青霉属、丝核菌属,四联球菌属、杜氏藻属、肺囊虫属、乳杆菌属、毛霉属、曲霉属和镰刀菌属广泛存在,发酵各阶段样品中菌属组成大体相似但比例不同。将鉴定到的微生物蛋白进行生物信息学注释,GO结果表明1368种蛋白主要与催化活性、结合力有关;COG结果表明这些微生物蛋白的功能性状参与了遗传信息处理和代谢途径,如碳水化合物代谢、氨基酸生物合成、能量代谢和核酸生物合成,这些核心功能主要涉及微生物之间的相互作用以及可能参与微生物获取养分的途径。相关通路的核心蛋白主要来自真菌中的芽孢杆菌、青霉菌和四联球菌。3.分析了沈阳青花食品酿造公司的三批9份工厂豆酱(14天,28天,42天)中微生物群落结构及其生物功能。对鉴定得到的1987种微生物蛋白进行物种注释,发现这些微生物蛋白主要来自担子菌门和子囊菌门。在属水平上,主要以黏滑菇属为主,在三个发酵时期所占比例差不多;其次是米曲霉属,在发酵中期数量最多;来自芽孢杆菌属、优杆菌属、脉孢菌属的蛋白所占比例稍小,其余微生物蛋白均不到1%。KOG注释表明生物功能主要参与翻译后修饰,蛋白质转换、翻译,核糖体结构与生物发生、碳水化合物的运输和代谢,相关通路中的核心蛋白主要来自真菌中的曲霉菌、青霉菌和毛霉菌,细菌作用不大。4.将工厂豆酱宏蛋白质组与农家豆酱宏蛋白质组进行了差异分析,共鉴定到了4299种差异蛋白。与农家豆酱相比工厂豆酱在物种组成上更加稳定和单一,独有的菌属有48种。GO注释结果表明两种豆酱的差异蛋白主要集中在蛋白与催化活性中,参与细胞组成和细胞膜成分,参与代谢过程和细胞过程。通过KEGG注释分析发现,在p<0.05水平下,组间微生物差异蛋白主要参与生物调控、细胞组件组织,生物起源,代谢过程,反应刺激。农家豆酱包含很多参与人类疾病相关代谢通路的蛋白,其中差异倍数最高的蛋白为来芽孢杆菌的Dna K应激蛋白,功能注释表明该蛋白参与弓形虫病,在食用性方面不如菌群组成更简单、稳定的工厂豆酱安全。5.通过UPLC-QTOF/MS对豆酱进行全谱代谢扫描,并结合宏蛋白质组结果从豆酱品质、食用安全性、功能性三个方面对主要代谢物的核心微生物进行注释,进一步明确各个物种的潜在功能和代谢特点。结果表明:在农家豆酱中碳水化合物代谢相关途径的核心微生物是青霉、四联球菌、曲霉、乳酸杆菌,是核心糖化微生物群。尤其是青霉,分泌最丰富的葡糖淀粉酶;四联球菌和明串珠菌对豆酱风味形成影响较大,脂质代谢的核心微生物是葡萄穗霉属;影响豆酱安全性的核心微生物主要是隐球菌。此外,我们从蛋白层面上确认了由四联球菌(Tetragenococcus halophilus、Tetragenococcus muriaticus)产生的鸟氨酸氨甲酰基转移酶是抑制氨基甲酸乙酯的关键酶。而在工厂豆酱中,核心微生物单一,主要为米曲霉、埃默森罗萨氏菌。本研究发现了很多之前并没有被与豆酱发酵过程相联系的酶,这些重要的酶系可为未来的传统自然发酵豆酱的品质和安全性研究提供一个重要的理论基础,也从侧面反应了豆酱发酵过程中微生物群落的多样性及其生物学功能的协同性。