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目的: 探讨诱导初始型T细胞向产IL-9 T细胞分化的条件，建立体外诱导Th9细胞的方法;观察在选定的诱导条件下细胞分化过程中可能发生的类型转化，以及相关细胞因子、转录因子的变化和信号转导途径。 方法: (1)MACS法分选初始型T细胞:无菌条件下，取6-8周龄雌性Balb/c小鼠脾脏，制成脾细胞悬液后通过磁珠分选出CD4+CD62L+初始型T细胞，经流式细胞仪分析其表面分子CD4以检测分选效率。 (2)产IL-9 T细胞的体外诱导和鉴定:分选得到的初始型T细胞用抗CD3和抗CD28激活，继后分别用不同浓度的IL-4和TGF-β诱导分化，5天后在经PE标记的IL-9 McAb和Per-cy5.5标记的IL-4 McAb进行胞内双色荧光染色，应用流式细胞仪分析不同浓度的IL-4和TGF-β对产IL-9 T细胞诱导的影响。 此外，分析不同诱导时间对产IL-9T细胞诱导的影响，即选择不同浓度的IL-4和TGF-β，分别刺激初始型T细胞不同时间，同样用流式细胞技术分析诱导结果。 (3)qRT-PCR法检测相关细胞因子和转录因子的mRNA表达水平:在本试验确定的最佳IL-4、TGF-β浓度条件下，对初始T细胞以不同时间进行诱导分化。收集诱导的细胞，提取RNA，经逆转录后行qRT-PCR法，检测IL-4、IL-9、PU.1、IRF-4和GATA-3等细胞因子和转录因子的表达水平。 (4)TGF-β信号通路重要分子Smad2、Smad3、Smad4等表达水平的测定:初始型T细胞相继经抗CD3和抗CD28激活和经IL-4和TGF-β诱导不同时间后，收集细胞做qRT-PCR检测，分析TGF-β信号通路重要分子Smad2、Smad3和Smad4的表达水平。 (5)统计学分析:通过GraphPad Prism5软件对流式结果做出相应线性图;应用GraphPad Prism5对定量结果做统计学分析，两组间的均数比较首先进行组间的方差齐性分析(Levene test)，方差齐采用非配对t检验，方差不齐则采用非参数检验，以P＜0.05为有统计学意义。 结果: (1)30 ng/ml IL-4和5 ng/ml TGF-β作用5天，即为本研究确定的诱导产IL-9 T细胞的最佳条件。在初始型T细胞分化为产IL-9 T细胞的过程中，可见诱导5天时产IL-9T比例随着IL-4浓度升高而增加，而利于产IL-9T细胞分化的TGF-β浓度以5 ng/ml为最佳，高或低于此浓度均不能有效地促进此类细胞的分化。 (2)产IL-9 T细胞分化过程经历IL-4+T细胞过渡阶段。初始型T细胞在不同浓度IL-4(10 ng/ml、30 ng/ml)和TGF-β(2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml)的培养条件下，于第3天首先分化为IL-4+T细胞，而第5天则分化为IL-9+T细胞。这一结果表明，在本研究采用的诱导条件下，Th9细胞的分化呈现从IL-4+T到IL-9+T分化的时序性。提示初始型T细胞分化为Th9细胞可能需要经历Th2细胞过渡阶段，拟或Th2细胞也可直接诱导为IL-9+T或Th9细胞。 (3)qRT-PCR结果表明，在选定的最佳诱导条件下，初始型T细胞经诱导后于第3天和第5天时细胞因子IL-4和IL-9的表达水平与此时的细胞类型一致。在诱导的第5天和第3天相比，Pu.1(Sfpi1)表达有所下降而Irf4表达则升高，Gata3无明显改变。 (4)TGF-β通路的信号分子Smad3和Smad4表达明显上调。qRT-PCR分析结果表明，初始型T细胞在30 ng/ml IL-4和5 ng/ml TGF-β刺激5天时，Smad3和Smad4的表达升高且明显高于诱导的第3天，而Smad2的表达则无明显改变。 结论: 体外，抗CD3和抗CD28预先激活的初始型T细胞，在IL-4(30 ng/ml)和TGF-β(5ng/ml)存在的条件下，经5天的时间可诱导出产IL-9T细胞;在诱导过程中经历了IL-4+T细胞过渡阶段，呈现从IL-4+T到IL-9+T分化的时序;在此诱导条件下，TGF-β通路的Smad3和Smad4信号转导有助于产IL-9T细胞的分化;IRF-4可能是产IL-9T细胞优势分化的重要转录因子。这一研究可为进一步认识Th9和Th2细胞的关系提供线索，并为Th9相关疾病发展和预防提供一个新视角。