黑豆中富含功能性植物化学物,尤其是酚酸,黄烷醇,异黄酮和花青素等具有高效生物活性功能的酚类物质,它们具有抗氧化、抗炎症、神经保护以及抗肿瘤活性。流行病学以及干预治疗研究结果表明定期食用黑豆在内的豆制品与多种慢性病如糖尿病和老年痴呆的发生呈负相关,同时黑豆也被当作传统中药用于预防和治疗心血管类疾病,如高血脂和动脉粥样硬化,以及雌激素代谢相关疾病如乳腺癌、前列腺癌和骨质疏松等,所以黑豆被认为在保持人体健康和预防慢性疾病方面发挥着重要作用。目前对于黑豆中富含的植物化学物的组成、分布、稳定性及其体外化学抗氧化活性的研究不够全面,对于结合在食物基质中的酚类化合物组成、食用后体内消化过程对可萃取型和结合型酚类化学物组成及其化学抗氧化活性的研究也未见相关报道。为深入了解黑豆的营养价值,本文以黑豆中的酚类化合物为主要研究对象,将其分为可萃取型酚类(Extractable phenolics)和结合型酚类(Bound phenolics),采用超高效液相-飞行时间质谱联用技术(UPLC-ESI-QTOF-MS/MS)和高效液相-三重串联四极杆质谱联用技术(HPLC-ESI-QqQ-MS/MS),定性定量分析其中植物化学物组成和结构。利用96孔板快速检测方法测定其体外抗氧化活性。同时,采用了模拟体外消化过程,研究消化过程中,黑豆酚类化合物在人体肠道内的生物可接受率。具体结果如下:1.采用UPLC-ESI-QTOF-MS定性分析黑豆80%甲醇酚类提取物中各类化合物成分,共鉴定出124种化合物,包括6种糖类:阿拉伯糖、葡萄糖、龙胆二糖、龙胆三糖、四糖和六糖;15种有机酸:葡萄糖醛酸、葡萄糖二酸、苏糖酸、葡萄糖型抗坏血酸、苹果酸、2,5-二酮葡糖酸,木糖酸、丙二酸、古洛糖型抗坏血酸、戊烯二酸、2-甲基顺式乌头酸、琥珀酸、奎宁酸、malyngic acid和酒石酸;6种酚酸:4-羟基扁桃酸,4-羟基扁桃酸已糖、阿魏酸、原儿茶酸已糖酰戊糖,原儿茶酸和绿原酸;15种异黄酮:大豆苷元、大豆苷、黄豆苷元、黄豆苷、染料木苷元、染料木苷、阿佛洛莫生葡萄糖苷、大豆苷元-4-葡萄糖苷、6-O-乙酰染料木苷、6-O-乙酰大豆苷、6-O-乙酰黄豆苷、红车轴草素、3’,4’,7-三羟基异黄酮、染料木苷元-5-O-葡萄糖苷和李属异黄酮甙;18种黄酮醇:槲皮素-7-O-已糖苷、山奈酚-7-O-B-D-葡萄糖苷、牡荆素、山奈酚3-O-葡萄糖苷、杨梅素芸香糖苷、芦丁、3-O-甲基杨梅素已糖苷、金丝桃苷、二羟基黄酮、三羟基黄酮、异鼠李素、二羟基黄酮异构体、槲皮素、芹菜素、杨梅素已糖苷、槲皮素-3-木糖苷-7-葡萄糖苷、槲皮素-3-半乳糖酸木苷和槲皮素-3-芹菜糖酰-a L-阿拉伯糖苷;8种黄烷酮:柚皮素-8-C-β-D-葡萄糖苷、花旗松素已糖苷、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、柚皮素、花旗松素、柚皮素-4’-O-葡萄糖苷、柚皮素-6-C-β-D-葡萄糖苷和柚皮素-7-O-半乳糖苷;13种黄烷醇:原花青素B及其三种异构体、原花青素C、儿茶素3-鼠李糖苷、表没食子儿茶素、儿茶素、原花青素C及其两种异构体、表儿茶素、原花青素A2和儿茶素四聚体;12种花青素:矢车菊素、飞燕草素、矮牵牛花素、天竺葵素、芍药花素以及它们各自的3-O-已糖苷、矮牵牛花素-3-O-(6”-丙二酰葡萄糖)和芹菜啶-3-O-(6”-丙二酰葡萄糖);21种皂苷:去乙酰基大豆皂苷Aa、大豆皂苷Aa、去氧大豆皂苷Aa、大豆皂苷Ae、大豆皂苷Ba、大豆皂苷Bb、大豆皂苷αg、大豆皂苷βg、大豆皂苷Ⅱ、大豆皂苷Ab、大豆皂苷A3、大豆皂苷Bb’(III)、大豆皂苷Be、大豆皂苷βa、大豆皂苷Bd、大豆皂苷IV、大豆皂苷Ah、大豆皂苷Ag、大豆皂苷VI、大豆皂苷Bd异构体和大豆皂苷Bb异构体;8种氨基酸:天冬氨酸、谷氨酸-酪氨酸、色氨酸、谷氨酸-苯丙氨酸、L-谷氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和酪氨酸;2种其他物质三异戊精和尿苷;以及2种未鉴别物质。2.利用UPLC-ESI-QTOF-MS定性黑豆结合型酚类组成,共鉴定出88种酚类化合物,包括23种酚酸及其酯类衍生物:对羟基扁桃酸、4-甲氧基邻苯二甲酸、二羟基苯甲酸及其两种异构体、3-O-甲基没食子酸、芥子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、香草酸、乙酰氧基甲氧基苯甲酸、二羟基苯甲酸已糖及其一种异构体、二羟基苯甲酸已糖、Woodorien、羟基间苯二酸、异阿魏酸、2-羟基苯甲酸、没食子酸及其一种异构体、甲氧基水杨酸、原儿茶酸和绿原酸;8种异黄酮:大豆苷、大豆苷元、黄豆苷、黄豆苷元、染料木苷、染料木苷元、6-O-乙酰基大豆苷和染料木苷元-5-O-葡萄糖苷;10种黄酮醇:鼠李素、杨梅素、六羟基黄酮、山奈-7-O-B-D-葡萄糖苷、牡荆素、芦丁、金丝桃苷、芹菜素、异鼠李素和槲皮素;6种黄烷酮:枳椇素Ⅰ、黄诺玛苷、蛇葡萄素、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、柚皮素和花旗松素;5种黄烷醇:儿茶素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素和原花青素A2;10种花青素包括矢车菊素、飞燕草素、矮牵牛花素、天竺葵素、芍药花素、芹菜啶、飞燕草素-3-O-半乳糖苷、矮牵牛花素-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和天竺葵素-3-O-半乳糖苷。3.96孔板法测定了可萃取型(EPE)和结合型酚类提取物(BPE)的总酚TPC和抗氧化活性(DPPH、ABTS、FRAP)。黑豆种皮与子叶中可萃取型总酚含量分别为38.04和10.60 mg GAE/g DW。种皮与子叶样品总抗氧化活性;DPPH分别为119.73和21.93,FRAP分别为251.84和19.94μmol FE/g DW,ABTS分别为165.86和8.43μmol TE/g DW。表明黑豆种皮的可萃取型酚类提取物高于子叶,抗氧活性也远远高于子叶,总酚与抗氧化活性间呈现明显的正相关性,说明酚类化合物是最主要的抗氧化活性物质。不同水解方法处理得到的种皮结合型总酚分别为9.33 GAE/g DW(酸处理结合酚提取物,A-BPE),1.63 GAE/g DW(酸-碱处理结合酚提取物,A-B-BPE),8.84 GAE/g DW(碱处理结合酚提取物,B-BPE)和3.01 GAE/g DW(碱-酸处理结合酚提取物,B-A-BPE);子叶结合型总酚分别为3.67 mg GAE/g DW(A-BPE),1.23 mg GAE/g DW(A-B-BPE),4.19 mg GAE/g DW(B-BPE)和1.54 mg GAE/g DW(B-A-BPE)。这些不同水解方法处理得到的种皮结合型提取物的DPPH、ABTS和FRAP抗氧化活性分别为6.76~23.53,6.92~27.16和47.53~133.14μmol TE(FE)/g DW;子叶结合型提取物的DPPH、ABTS和FRAP抗氧化活性分别为0.42~8.79,0.66~5.35和1.82~7.86μmol TE(FE)/g DW;这三种抗氧化活性实验中,种皮结合型酚提取物的酸处理法抗氧化活性最高。抗氧化活性与提取物中所含总酚含量呈正相关,说明总酚是黑豆结合型酚类提取物中最主要的抗氧化活性物质。4.96孔板法测定了结合型酚类提取物酶水解产物和黑豆模拟体外消化产物的总酚和抗氧化活性。种皮结合型酚类提取物经不同酶水解处理后总酚含量分别为1.07 mg GAE/g DW(β-葡聚糖酶),0.45 mg GAE/g DW(木聚糖酶),10.97 mg GAE/g DW(纤维素酶),16.52 mg GAE/g DW(半纤维素酶);子叶结合型酚类提取物经不同酶水解处理后总酚含量分别为0.51 mg GAE/g DW(β-葡聚糖酶),0.54mg GAE/g DW(木聚糖酶),2.42 mg GAE/g DW(纤维素酶),1.04 mg GAE/g DW(半纤维素酶);种皮结合型酚类提取物的不同酶水解产物的DPPH、ABTS和FRAP抗氧化活性分别为2.08~5.78、11.16~165.90和4.96~77.19 TE(FE)/g DW;子叶结合型酚类提取物的不同酶水解产物的DPPH,ABTS和FRAP抗氧化活性分别为0~0.52,9.07~36.51和3.29~13.56 TE(FE)/g DW。此外,我们分别研究了黑豆种皮和子叶模拟体外消化产物的总酚含量及其抗氧化活性。种皮在连续消化的不同阶段(胃和小肠)产物的总酚含量为6.22~13.39 mg GAE/g DW,而子叶则为5.36~8.65 mg GAE/g DW;种皮在连续消化的不同阶段(胃和小肠)产物的DPPH、ABTS和FRAP抗氧化活性分别为8.80~22.35、25.97~60.64和24.69~117.35 TE(FE)/g DW,而子叶产物的DPPH、ABTS和FRAP抗氧化活性分别为0~2.37、3.18~6.90和2.71~7.83 TE(FE)/g DW。结果表明,黑豆种皮消化后产物总酚和抗氧化活性均比子叶高,且消化过程对黑豆中结合型酚类的释放能力有限。