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猪食道口线虫(Oesophagostomum.ssp)属于圆形目(Strongylida)夏柏特科(Chabertidae)食道口属(Oesophagostomum)的一类体内寄生性线虫,成虫寄生于猪的大肠,因其幼虫寄生在肠壁上形成结节状病变,故又有猪“结节虫”之称。目前公认的寄生于猪体内的常见食道口线虫主要包括有齿食道口线虫(0.dentatum)和四棘食道口线虫(0.quadrispinulatum)两个种。本论文分别对采自我国广东、重庆、湖南和黑龙江等地区的猪食道口线虫核糖体基因间隔区(IGS rDNA)进行了克隆和序列分析。通过比对和分析两个种的IGS序列差异,设计引物,优化条件,建立区分两个种的高分辨率溶解曲线(High Resolution Melting,HRM)分子鉴定方法。 本论文的第一部分对我国广东、湖南、黑龙江和重庆四个地区的26个有齿食道口线虫和四棘食道口线虫样品IGS rDNA序列进行PCR扩增、克隆及序列结构分析,从IGS rDNA序列的角度研究猪食道口线虫的种内和种间遗传变异情况。测序及分析结果显示,有齿食道口线虫和四棘食道口线虫两个种的IGS rDNA序列具有高度多态性,长度从1019 bp至1388 bp;有齿食道口线虫的种内序列相似性为92.7%-99.8%,四棘食道口线虫的种内序列相似性为70.7%-99.9%,两种食道口线虫种间差异为38.7%-52.8%。可见食道口线虫IGS rDNA序列种内差异较小而种间差异很大,其中四棘食道口线虫IGS rDNA序列在不同地区的个体间存在较大差异,种内序列差异性大于有齿食道口线虫。本实验首次报道并分析了猪有齿食道口线虫和四棘食道口线虫的核糖体IGS rDNA序列的遗传变异情况,该结果为猪食道口线虫种间的准确鉴定提供了新的、有效遗传标记。 本论文第二部分基于有齿食道口线虫和四棘食道口线虫IGS rDNA序列的遗传变异情况,在种内保守、种间差异明显的序列片段设计引物,建立了区分两种猪食道口线虫的高分辨率溶解曲线(HRm)分子鉴定方法。研究结果显示,HRM分子鉴定方法可以通过溶解曲线差异而准确鉴定猪食道口线虫虫种,与其他线虫和吸虫无交叉反应,特异性良好;敏感性试验显示最低能检测到18×10-3 ng/μL的有齿食道口线虫DNA和24.4×10-4 ng/μL的四棘食道口线虫DNA;能检测单虫卵样品和FTA卡片的DNA模板。HRM检测方法的建立为猪食道口线虫种类准确鉴定提供了一种新的准确、敏感、特异、快速的分子手段。