论文部分内容阅读
【目的】尿道狭窄的治疗目前仍是困扰泌尿外科医生的难题,目前腔内和药物治疗的效果欠佳。间充质干细胞(MSC)用于治疗尿道狭窄有一定疗效,但是机制未明。有研究表明使用促炎细胞因子刺激可以强化MSC对尿道狭窄的作用效果。本研究利用肿瘤坏死因子α(TNF-α)预处理的人脐带来源的MSC外泌体对大鼠尿道狭窄的影响及作用机制【方法】TNF-α预处理MSC后,提取TNF-α诱导的MSC的外泌体(αMSCexo)和未经TNF-α处理的MSC外泌体(MSC-exo),检测外泌体mi R-146a的表达情况。雄性Sprague-Dawley大鼠使用TGF-β1(转化生长因子β1)诱导并切开阴茎部位尿道构建尿道狭窄模型,分别于大鼠阴茎部位尿道注射MSC-exo(50μg)和αMSC-exo(50μg),实验分四组,对照组,TGF-β1组(只注射TGF-β1),T+MSC-exo组(注射TGF-β1加未经处理的MSCexo)和T+αMSC-exo组(注射TGF-β1加TNF-α处理的MSC-exo)。四周后,超声评估大鼠尿道狭窄情况,处死大鼠获取尿道组织行组织学分析。体外实验中,MSC-exo和αMSC-exo分别作用于成纤维细胞中,划痕实验观察各组外泌体对成纤维细胞迁移的影响。q RT-PCR测定相关外泌体作用成纤维细胞后其中mi R-146a的表达情况;免疫荧光,q RT-PCR和Western blot分析各组成纤维细胞中αSMA、I和III胶原蛋白表达情况;Western blot和q RT-PCR检测IRAK1、TRAF6、NF-κB通路蛋白的表达。抑制αMSC-exo中mi R-146a的表达,q RT-PCR和Western blot检测成纤维细胞αSMA、I和III胶原蛋白表达情况的变化。【结果】大鼠尿道超声图像显示用TNF-α预处理的MSC的外泌体比未经处理的MSC的外泌体更有效地抑制尿道纤维化和狭窄。免疫组化显示T+αMSCexo组中αSMA表达较TGF-β1组和T+MSC-exo组显著降低,Masson三色(Masson trichrome MT)染色和H&E(hematoxylin-eosin)染色也显示在T+αMSC-exo治疗组仅存在轻度粘膜下尿道组织纤维化。体外细胞实验发现αMSC-exo组细胞迁移能力显著高于MSC-exo组(P<0.05)。免疫荧光、Western blot及q RT-PCR显示与T+MSC-exo组相比,T+αMSC-exo组αSMA、Collagen I和CollagenⅢ的蛋白和m RNA表达水平显著降低(P<0.05)。TNF-α刺激MSCs后细胞内的mi R-146a显著上调,并选择性地包装到外泌体中。Western blot及q RT-PCR显示T+αMSC-exo组IRAK1、TRAF6、NF-κB蛋白和m RNA表达水平均低于T+MSC-exo组(P<0.05)。在TNF-α处理的MSC外泌体中抑制mi R-146a表达,与未抑制组相比,αSMA、Collagen I和CollagenⅢ的蛋白和m RNA表达水平显著增高,具有统计学意义(P<0.05)。【结论】TNFα能够增高MSC外泌体mi R-146a的水平,并且增高的mi R-146a可抑制IRAK1/TRAF6/NF-κB信号通路加强其治疗尿道狭窄的疗效。