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研究背景与目的： 结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）的死亡率居全球恶性肿瘤的第4位，其发病率和死亡率近年在我国有持续升高的趋势。CRC的侵袭转移和化疗不敏感是影响治疗效果和生存预后的重要制约因素。因此，阐明CRC侵袭转移机制并寻找新而有效的治疗靶标以抑制其侵袭转移及增加化疗敏感性是提高CRC临床疗效和降低死亡率的关键所在。 β半乳糖苷凝集素-3（Galectin-3）被称为肿瘤相关蛋白，研究表明，Galectin-3一方面参与调节肿瘤细胞的生长、凋亡、黏附、血管生成，另一方面还介导肿瘤侵袭和转移，但其调节机制尚不清楚。本课题将进一步明确Galectin-3在CRC侵袭转移及化疗反应中的作用，并初步探讨Galectin-3在CRC中的表达调控机制。 研究方法： （1）采用Western blot和免疫组化方法分别检测Galectin-3在结直肠癌细胞及结直肠癌组织中的蛋白表达情况。 （2）构建Galectin-3的过表达载体及空白对照载体，用脂质体法转染Hela细胞。实时荧光定量PCR及Western blot验证转染效果。分别应用Transwell细胞侵袭实验和MTS实验检测Galectin-3过表达前后侵袭能力和药物敏感性变化。 （3）利用生物信息学在线预测软件分析筛选出可能靶向调控 Galectin-3表达的miR-128。利用qRT-PCR的方法检测了所有结肠癌细胞及Hela细胞miR-128的表达，筛选出 miR-128表达水平最低的结直肠癌细胞 SW620、HT-29作为后续实验的细胞模型。将has-miR128-3p minics分别转染结直肠癌细胞SW620、HT-29后，采用实时荧光定量PCR及Western blot检测细胞中Galectin-3的表达情况。利用Transwell细胞侵袭实验和MTS法分别检测miR-128转染组及对照组的侵袭能力及药物敏感性变化。将miR-128和重组有Galectin-3基因3’-UTR区miR-128潜在结合位点的野生型和突变型的荧光素酶报告基因分别共转染293T细胞，24小时后检测荧光素酶活性，进一步验证miR-128对Galectin-3的直接靶向调控作用。 （4）在已转染miR-128的SW620和HT-29细胞中过表达Galectin-3，Western blot、qPCR检测Galectin-3的表达，Transwell细胞侵袭实验及MTS检测结肠癌细胞的生物学行为变化。 结果： （1）Western blot结果显示：10株结直肠细胞中（Caco2、HT-29、HCT8、HCT116、SW480、SW620、LOVO、RKO、LS174T、DLD1）均普遍高表达 Galectin-3。免疫组化显示：Galectin-3在结肠癌组织中主要定位于细胞的胞浆及胞核，其阳性表达率为86.4％，在正常组织中阳性表达率为22.0%，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；Galectin-3的表达水平与是否存在淋巴结转移、TNM分期有关（P＜0.05）；而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤最大直径、分化程度、术前CEA水平无关（P＞0.05）。 （2）在Galectin-3表达丰度较低的Hela细胞中过表达Galectin-3后，Transwell细胞侵袭实验检测结果显示：转染空白质粒组 Hela细胞迁移至下室的细胞数目为（86.33±4.910）个，过表达 Galectin-3的 Hela细胞迁移至下室的细胞数目为（213.0±4.933）个，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。使用顺铂、奥沙利铂、5-Fu和紫杉醇处理分别转染空白质粒和Galectin-3过表达后的Hela细胞，MTS检测细胞活性结果提示：过表达Galectin-3的Hela细胞对顺铂、奥沙利铂、5-Fu和紫杉醇的药物敏感性明显降低，与同等药物浓度处理的转染空白质粒组的 Hela细胞活性相比，差异具有显著性（P＜0.05）。结果提示过表达Galectin-3的Hela细胞的侵袭转移能力及抗药性均明显增加。 （3）通过生物信息学在线预测软件分析，发现 miR-128可能靶向调控 Galectin-3的表达。qRT-PCR检测发现在10株结肠癌细胞中miR-128的表达均明显低于Galectin-3低表达的Hela细胞（P＜0.05），提示miR-128的表达模式与Galectin-3表达模式呈负相关。初步提示两者之间可能存在负调控关系。使用miR-128特异性的minics转染miR-128低表达的HT-29和SW620细胞，Western blot和qRT-PCR检测两组细胞转染前后Galectin-3的表达，发现在HT-29和SW620细胞中，转染miR-128特异性的minics后，mRNA水平和蛋白水平Galectin-3的表达均显著低于阴性对照组，两者相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示miR-128的表达上调可以引起Galectin-3的表达下调。进一步采用双荧光素酶报告基因实验，结果也证实miR-128可以通过与Galectin-3基因3’-UTR区miR-128预测结合位点相结合，从而直接负向调控Galectin-3的表达。 （4）在结肠癌细胞HT-29和SW620中通过转染miR-128特异性minics恢复其中miR-128的表达水平。Transwell细胞侵袭实验检测结果发现：转染阴性对照的HT-29和SW620细胞迁移至下室的细胞数目分别为（41.33±0.8819）个和（107.3±2.028）个，转染miR-128 minics后HT-29和SW620细胞迁移至下室的细胞数目分别为（7.333±0.8819）和（28.33±0.8819），明显少于阴性对照组，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。提示 miR-128高表达可以显著抑制结肠癌细胞的侵袭能力。继而使用不同浓度的顺铂、奥沙利铂、5-Fu和紫杉醇分别处理转染了阴性对照和miR-128 minics的HT-29和SW620细胞，结果提示：相同浓度的化疗药物处理下，转染miR-128 minics的HT-29和SW620细胞的活性显著低于阴性对照组，差异具有显著性（P＜0.05），提示 miR-128过表达可以增强结肠癌细胞对药物的敏感性。 （5）在结肠癌细胞HT-29和SW620中，转染miR-128 minics引起Galectin-3低表达后，再分别转染空白载体pLEX/MCS和Galectin-3过表达载体pLEX/Gal-3，同样重复 Transwell细胞侵袭实验及药敏实验，结果发现：转染空白载体pLEX/MCS的HT-29和SW620细胞迁移至下室的细胞数目分别为（8.667±0.8819）个和（41.33±2.028）个，而这一数据在转染pLEX/Gal-3的HT29和SW620细胞中分别为（123.0±1.732）个和（180.7±1.764）个，前者明显低于后者，两者比较差异具有显著性（P＜0.05）。药敏实验发现：相同浓度的化疗药物处理分别转染pLEX/MCS和pLEX/Gal-3的HT-29和SW620细胞，转染pLEX/Gal-3的HT-29和SW620细胞的活性明显高于转染空白载体pLEX/MCS的HT-29和SW620细胞，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。这一结果再次证实 miR-128是通过直接靶向调控Galectin-3的表达发挥抑制结肠癌细胞侵袭转移以及增强其对化疗药物敏感性的作用的。 结论： （1） Galectin-3在结肠癌细胞和结直肠癌组织中普遍高表达；在结直肠癌患者中，其高表达与患者存在淋巴结转移及临床分期密切相关。 （2） Galectin-3表达水平上调可以增强Hela细胞和结直肠癌细胞侵袭能力以及增强其对多种化疗药物的耐受性。 （3） miR-128可以直接通过与Galectin-3基因3’-UTR区结合负调控Galectin-3的表达。 （4） miR-128通过直接靶向调控 Galectin-3的表达，抑制结肠癌细胞侵袭能力，增强结肠癌细胞对多种化疗药物的敏感性。