卵黄高磷蛋白(PV)是自然界中磷酸化程度最高的蛋白之一,其丝氨酸的含量超过氨基酸总量的55%,其中80%的丝氨酸磷酸化,据报道其水解之后的磷酸肽具有更强的抗氧化等生物活性,基于实验室前期关于PV的工作基础,本论文主要以制备的卵黄高磷蛋白磷酸肽PPP4为研究对象,从最初观察其与钙的结合情况入手,进一步通过体外胶原蛋白矿化和细胞矿化研究对骨的矿化的影响,最后基于其在体外模型中能促进胶原纤维内部的矿化和成骨细胞细胞基质矿化的作用,为开发促进骨骼发育的功能食品奠定基础。主要研究内容及得到的结论如下:通过ITC研究发现了PPP4与钙离子有三类结合位点,其焓变△H由负变正再变负,说明钙离子与PPP4的结合是先放热再吸热再放热的过程,三类结合位点的△G<0,说明这三类结合位点是热力学自发的行为。ISE拟合的两类结合常数均达到104mol-1,高亲和位点的结合常数为7.875×104,低亲和位点的结合常数为2.942×104,且具有低亲和位点数目(2.833)高于高亲和位点数(1.587)的特点。随着钙离子浓度的增加,PPP4的结构更加紧密,刚性结构增强,其中β-折叠比例增加了27.8%,β-转角减少37.5%,钙离子对PPP4的荧光猝灭呈自然对数增加的模式,猝灭作用逐步放缓。以体外胶原蛋白膜为基质,以PILP理论为指导,研究了PV和PPP4在钙磷仿生矿化体系中对胶原蛋白矿化的影响。首先制备了胶原蛋白膜,通过SEM/EDS、TEM/SAED和XRD的方法观察了胶原蛋白膜上矿物的沉积状况形貌、晶体的晶型、胶原蛋白矿化后的形貌以及矿物在胶原蛋白基质上的分布。发现PV和PPP4能够调控胶原纤维内部的矿化,促进ACP向HAP的转变,形成的磷灰石晶体在胶原纤维表面也有分布。矿化2d时,对照组的EDS显示Ca/P=1.67,羟磷灰石(HAP)已形成,而此时PPP4组的Ca/P=1.93,主要是无定型磷酸钙(ACP)。矿化14d后,PPP4和PV组有明显的羟磷灰石特征峰。荧光光谱的分析表面PV和PPP4在矿化溶液里面的微观结构并未发生剧烈变化。通过BSA组和空白对照组相比较发现PV和PPP4调控胶原纤维的矿化的发生是一个缓慢有序的过程。以PPP4钙结合实验以及其对胶原蛋白矿化的调控作用为基础,进一步以成骨细胞MC3T3-E1为模型,研究PPP4对其增殖、凋亡、早期分化和后期矿化的影响。PPP4浓度为100μg/mL时,细胞增殖活力与对照组相比增加了32%,PPP4浓度为200μg/m L时,增殖活力增加45%。检测PPP4对细胞凋亡的影响时发现添加不同浓度PPP4后,各组细胞凋亡比率均不超过10%。通过ALP和茜素红染色发现PPP4对成骨细胞分化的影响是缓慢的作用,高浓度长时间的作用反而不利于成骨细胞的分化。制备PPP4与钙的复合物,单因素研究确定其制备工艺为肽钙质量比3:1、反应时间50min、反应温度50℃、反应pH7.5。红外光谱显示PPP4的羧基、氨基和磷酸基团均参与了钙结合。DSC显示PPP4与钙结合之后其热稳定性无明显变化,均达到122℃。PPP4-Ca经过热和冻融处理后稳定性良好,钙保留率维持在98%,消化后钙保留率73.45%。