共生菌对柑橘大实蝇取食选择的影响及宏基因组测序分析

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植食性昆虫的取食选择对昆虫和植物之间的协同进化十分关键,而共生物在昆虫取食选择中发挥重要作用。柑橘大实蝇是柑橘类果树的主要害虫,幼虫寡食性,仅取食芸香科柑橘属果实。共生物如何调控柑橘大实蝇的取食选择并影响其食性?基于此问题,本文通过研究柑橘大实蝇成虫取食选择,明确共生物对成虫取食行为及其适合度的影响,利用荧光标记技术研究共生菌在柑橘大实蝇肠道的定殖及传递,并通过细菌分离培养、16S rDNA扩增子测序和宏基因组测序技术阐明肠道共生物多样性及功能。主要结论如下:1.共生菌对柑橘大实蝇成虫取食选择的影响柑橘大实蝇成虫羽化后必须大量取食才能性成熟,为了解共生菌在成虫取食选择中的作用,设计了不同体积(1μL、5μL)、不同类型的饲料,包括含有必需氨基酸和非必需氨基酸的全饲料(Full diet,F)、仅含非必需氨基酸的(Non-Essential amino-acid diet,NE)饲料,观察抗生素处理后的成虫(共生菌减少)对不同饲料的选择。结果表明:(1)抗生素处理后的雌雄成虫趋向F饲料,相比对照组,抗生素处理后的成虫更快选择饲料并进行取食,雌、雄虫取食F饲料的量分别为11.77μL和9.53μL,显著高于对照组。(2)当在F饲料或NE饲料中添加益生菌(产酸克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌)后,成虫对饲料的选择性及取食量均显著增加。(3)当给予成虫不同类型饲料时,抗生素处理组的雌虫产卵量显著减少。2.肠道细菌在柑橘大实蝇体内的传递和分布利用荧光蛋白标记技术,对产酸克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌三种细菌在柑橘大实蝇肠道的分布及传递进行了研究。结果显示,产酸克雷伯菌在柑橘大实蝇成虫取食48 h后开始形成生物膜,72 h后在肠道中数量增多并形成厚厚的生物膜。另外,产酸克雷伯菌在成虫卵巢和卵中都有分布,暗示产酸克雷伯菌能经卵垂直传递。弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌也能成功定殖于肠道,在成虫取食48 h后开始形成生物膜,在72 h后生物膜变厚,但它们在成虫卵巢和卵中均未检测到。3.取食不同食料的柑橘大实蝇幼虫肠道共生物的差异昆虫肠道共生物因食料的不同而发生变化,比较了取食人工饲料、成熟脐橙、未成熟蜜橘和未成熟脐橙后大实蝇的卵和幼虫的发育情况,分析了二龄幼虫肠道共生物的差异。结果表明:(1)未成熟蜜橘和未成熟脐橙能显著缩短卵的孵化时间;人工饲料显著提高一龄幼虫和二龄幼虫的存活率。(2)通过细菌培养技术分离鉴定了二龄幼虫肠道可培养细菌共10种,均包含产酸克雷伯菌。(3)采用16S rDNA测序技术分析了以不同食料为食的二龄幼虫肠道共生物的多样性,表明普罗威登斯菌属在取食人工饲料的幼虫肠道中丰度最大,超过90%,但在以脐橙、蜜橘和椪柑为食的幼虫肠道中比例很低,以脐橙和椪柑为食的幼虫肠道中丰度最高的是肠杆菌属,分别为82.56%和38.58%,以蜜橘为食的柑橘大实蝇二龄幼虫肠道中丰度最高的是不动杆菌属,丰度为31.30%,表明柑橘大实蝇二龄幼虫肠道共生物的多样性受到食料的影响。4.宏基因组测序分析柑橘大实蝇肠道细菌功能通过宏基因组测序分析了成虫、二龄幼虫和蛹肠道共生物多样性及功能。结果表明:(1)成虫、蛹和二龄幼虫肠道优势菌属存在差异:柠檬酸杆菌属在成虫肠道丰度最大,达33.36%,但在蛹和二龄幼虫肠道中丰度很低;肠球菌属在二龄幼虫肠道中丰度最大,占比为15.90%,但在成虫和蛹肠道中丰度较低。表明大实蝇肠道共生物因发育阶段不同而发生变化。(2)参与碳水化合物代谢的共生菌主要是肠杆菌属,包括参与编码纤维素降解和果胶降解的酶。(3)肠道共生物参与固氮和氨基酸合成,主要是肠杆菌目、乳杆菌目和假单胞菌目。(4)柑橘大实蝇肠道内参与寄主植物解毒防御的共生物主要有肠球菌属、乳球菌属、柠檬酸杆菌属和肠杆菌属。综上所述,共生物影响柑橘大实蝇成虫的取食选择及适合度;产酸克雷伯菌能在成虫肠道及卵巢定殖并经卵垂直传递;宏基因组测序分析表明柑橘大实蝇肠道共生物参与了碳水化合物的代谢和固氮作用,为宿主提供营养,同时参与寄主植物解毒防御,提高幼虫免疫防御能力。上述结果为我们深入理解昆虫肠道共生物的生理功能以及共生物与昆虫食性之间的联系提供了重要的理论依据。
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