【摘 要】
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为了简化重组绿脓杆菌外毒素A(SPEA)结合区(Ia区)蛋白的下游分离纯化工作,该实验用聚合酶链式反应(PCR)扩增了B10质粒上含有目的基因(SPEA Ia区蛋白基因)的长约891bp的DNA序
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为了简化重组绿脓杆菌外毒素A(SPEA)结合区(Ia区)蛋白的下游分离纯化工作,该实验用聚合酶链式反应(PCR)扩增了B10质粒上含有目的基因(SPEA Ia区蛋白基因)的长约891bp的DNA序列,并在扩增产物的两端引入EcoR Ⅴ、Hind Ⅲ核酸内切酶酶切位点.扩增产物经低熔点琼脂糖法回收纯化后,将891bp片段连接到T载体上,并转化JM109感受态大肠杆菌菌株.含重组质粒的细菌菌落经α-互补实验筛选,EcoR Ⅴ、Hind Ⅲ对酶切鉴定后,选取含有目的片段质粒的菌落,经扩增培养后提取质粒,用EcoR Ⅴ、Hind Ⅲ核酸内切酶处理,并用低熔点琼脂糖法回收891bp片段.同时用相同的核酸内切酶处理pET-20b(+)质粒,并用DNA WIZARD cleanup system回收3800bp大片段.将经过处理的T载体小片段和pET-20b(+)质粒酶切大片段用T4 DNA连接酶连接,并转化DH5α感受态大肠杆菌菌株.增菌培养并提取质粒.经Xbal-BglⅡ、Xhol-EcoR Ⅴ多酶切鉴定,分别产生770bp、910bp小片段.基本与预期的SPEAIa基因酶切值相符合.
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