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摘要：目的：了解巴豆中巴豆苷的提取纯化及制备方法。
方法：开展正交试验，以巴豆苷得率为综合评定指标，筛选出最优的提取工艺参数，对大孔树吸附脂纯化工艺方案进行系统考察，结合高效液相色谱法，测定并分离巴豆苷纯度。
结果：8倍量、浓度为20％的乙醇，并连续提取3次，每次持续40min，即为最优巴豆苷提取工艺参数；初步纯化大孔树脂后，可将分离出来的巴豆苷单体作为对照物，其质量分数为98％。
结论：建立高效液相色谱条件，优化提取工艺参数，简便易行，可进行高纯度巴豆苷样品的制取，提高巴豆药材质量标准。
关键词：巴豆 巴豆苷 制备
Doi:10.3969/j.issn.1671-8801.2014.07.601
【中图分类号】R9【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801(2014)07-0370-01
巴豆属于大戟科植物巴豆的成熟种子，性热、辛，盛产于广西、湖北、福建、广东、湖南等地，巴豆品种药源丰富，含脂肪油、生物碱以及植物蛋白等，药理作用显著，可致泻、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、促肿瘤，但有急性毒性以及致炎、致癌作用，对黏膜及门腔的刺激作用强烈,易诱发红肿、水疱[1]。本文主要结合高效液相法，对巴豆中的巴豆苷含量进行测定，综合正交试验，优选其提取方案，以大孔树脂纯化提取物为对照品，制备液相，进而将巴豆苷单体进行分离，相关报告如下。
1 资料与方法
1.1 试剂与仪器。巴豆，选自该地区药材市场，经相关研究员鉴定。D101型大孔树脂，选自天津波鸿树脂科技有限公司。对照品巴豆苷选自上海谷研实业有限公司，纯度在98％以上。结合高效液相色谱仪（上海仪电分析仪器有限公司产品，型号为LC-200，存在二根70mm-250mm柱管），选取电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司产品，型号为FA1204B），乙腈与甲醇均为色谱纯，其他试剂属于分析纯。
1.2 一般方法。
1.2.1 巴豆苷含量测定方法。首先，选取色谱条件，进行系统适用性试验。利用色谱柱与流动相水-甲醇，作洗脱处理，调整柱温，使其保持为30℃，流速为1.0mL•min－1，波长为220nm，总记录时间达45min左右，进样量为10μL。理论塔板数＞5000。其次，进行溶液配制。称取适量巴豆苷，加水制成巴豆苷对照品溶液，为6.04g•L－1。随后，绘制曲线。取溶液标本1.5、1.2、1.0、0.5、0.2、0.1mL，将其分别放置于量瓶中（10mL），结合高效液相色谱法，纵坐标以峰面积，横坐标为样品进样量，绘制标准曲线。接着，制备供试品溶液。取10g巴豆、乙醚索氏提取去油打粉，药渣采用乙醇回流进行提取，结合过微孔滤膜，可得供试品。最后。进行正交试验设计。依据预试验显示结果，取乙醇体积分数、料液比、提取次数以及提取时间这四个因素，每因素择取3个水平，进行正交试验。
1.2.2 巴豆苷大孔树脂纯化工艺。取500g巴豆种子药材，提取乙醚索氏3h，作去油处理，药渣采用8倍量、浓度为20％的乙醇，回流连续提取3次后过滤，将提取液进行合并，回收溶剂后浓缩，使其为1.5g•mL－1，可得巴豆苷提取液。按照预试验显示结果，经由泄露曲线，结合已处理的D101型大孔树脂，明确上样药材用量与树脂比纯化效果，加入制备的提取液，调整上样液流速，用浓度为2％的乙醇进行冲洗，并合并冲洗液。经由纯度测定，提取液样纯化前巴豆苷质量分数，以甲醇-水为流动相，采用甲醇-水体系，分析巴豆苷分离状况以及出峰时间，选取合适上样量。
2 结果
经由上述参数设定后，以巴豆苷含量计，经由上样量分离后，观察峰形变化，发现上样量在20mg以上时，分离度呈下降趋势，而样品纯度将会出现下降，故巴豆苷＞20mg的溶液相对较好，流动相甲醇-水设定为7∶93，且流速在20mL•min－1，可得出制备液相图谱。予以巴豆苷回收溶剂真空干燥处理，结合HPLC检测法，取巴豆苷粉末进行测验检测，其纯度为98％时，总得率达51％左右。
3 结论
巴豆生物碱药理活性显著，临床上用于胃癌治疗已经取得了较为显著疗效，能改变蛋白质空间结构构象，促进人胄癌细胞SGC-7901死亡。同时，可阻滞HL-60细胞生成,诱发细胞分化，增强HI-60细胞NBT还原能力明显，有望成为白血病临床治疗诱发分化剂。在现阶段，对巴豆生物碱药学研究较少,一般先进行预试验,分析其溶解性质后，结合当前分离纯化技术，进行提取。据相关文献报道显示，小量巴豆作去油处理后，使用160倍量水，对巴豆苷含量进行测定，效果往往不佳[2]。究其根源，使用此种方法由于水溶性杂质相对较多，且回收较为困难，样品极其容易出现变质等现象，不易制取高纯度巴豆苷实验样品[3]。本文研究显示，采用正交设计，选用8倍量、浓度为20％的乙醇进行回流提取，总提取次数为3次,每次持续40min，可从根本上优化巴豆苷提取工艺参数，进而择取低体积分数的乙醇提取物，当流动相甲醇-水设定为7∶93，流速为20mL•min－1，且巴豆苷在20mg以上时，效果最优，可进行液相图谱的制备，最大限度地避免上述一系列的问题。从本质上来讲，采用DEAE纤维素，树脂前处理较为繁琐，且缓冲盐使用要求极为严格，纯化效果往往不佳。此外，DEAE纤维素成本高，与D101型大孔树脂相比，是其的几十倍，且再生繁琐。经由大孔树脂纯化，可提取高纯度巴豆苷。另外，制备液相可优化分离巴豆苷，予以HPLC检测后，可取纯度高达98％的巴豆苷单体，操作方法异常简单，同时分离效率相对较高，制取的产品质量优越，一定程度上有助于巴豆苷的制备，对于进一步开展巴豆苷药理研究起着举足轻重的作用。
综上所述，为了最大限度地纯化巴豆苷的纯度,必须要优化大孔树脂选择，严格筛选不同种类的大孔树脂，纯化大孔树脂，保证其在吸附率与解析率等方面的优势，综合考察洗脱剂、上样量等影响因素,结合巴豆苷对照品标准曲线，从而从根本上优化巴豆苷纯化条件，构建高效液相色谱条件，优化工艺参数，分析巴豆苷分离状况，得出最优出峰时间，可制取高纯度巴豆苷实验样品，一定程度上提升了巴豆药材质量标准。
参考文献
[1] 林彦君,傅超美,章津铭等.基于不同剂量比的巴豆配伍桔梗“减毒”作用机制探讨[J].中国实验方剂学杂志,2011（13）:178-181
[2] 李生梅,曾宝,黄孟秋等.巴豆中巴豆苷的提取纯化及制备[J].中国实验方剂学杂志,2012（06）:21-24
[3] 曾宝,黄孟秋,唐君苹等.巴豆炮制新工艺及其生品与炮制品的对比研究[J].中药材,2012（03）:371-375
方法：开展正交试验，以巴豆苷得率为综合评定指标，筛选出最优的提取工艺参数，对大孔树吸附脂纯化工艺方案进行系统考察，结合高效液相色谱法，测定并分离巴豆苷纯度。
结果：8倍量、浓度为20％的乙醇，并连续提取3次，每次持续40min，即为最优巴豆苷提取工艺参数；初步纯化大孔树脂后，可将分离出来的巴豆苷单体作为对照物，其质量分数为98％。
结论：建立高效液相色谱条件，优化提取工艺参数，简便易行，可进行高纯度巴豆苷样品的制取，提高巴豆药材质量标准。
关键词：巴豆 巴豆苷 制备
Doi:10.3969/j.issn.1671-8801.2014.07.601
【中图分类号】R9【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801(2014)07-0370-01
巴豆属于大戟科植物巴豆的成熟种子，性热、辛，盛产于广西、湖北、福建、广东、湖南等地，巴豆品种药源丰富，含脂肪油、生物碱以及植物蛋白等，药理作用显著，可致泻、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、促肿瘤，但有急性毒性以及致炎、致癌作用，对黏膜及门腔的刺激作用强烈,易诱发红肿、水疱[1]。本文主要结合高效液相法，对巴豆中的巴豆苷含量进行测定，综合正交试验，优选其提取方案，以大孔树脂纯化提取物为对照品，制备液相，进而将巴豆苷单体进行分离，相关报告如下。
1 资料与方法
1.1 试剂与仪器。巴豆，选自该地区药材市场，经相关研究员鉴定。D101型大孔树脂，选自天津波鸿树脂科技有限公司。对照品巴豆苷选自上海谷研实业有限公司，纯度在98％以上。结合高效液相色谱仪（上海仪电分析仪器有限公司产品，型号为LC-200，存在二根70mm-250mm柱管），选取电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司产品，型号为FA1204B），乙腈与甲醇均为色谱纯，其他试剂属于分析纯。
1.2 一般方法。
1.2.1 巴豆苷含量测定方法。首先，选取色谱条件，进行系统适用性试验。利用色谱柱与流动相水-甲醇，作洗脱处理，调整柱温，使其保持为30℃，流速为1.0mL•min－1，波长为220nm，总记录时间达45min左右，进样量为10μL。理论塔板数＞5000。其次，进行溶液配制。称取适量巴豆苷，加水制成巴豆苷对照品溶液，为6.04g•L－1。随后，绘制曲线。取溶液标本1.5、1.2、1.0、0.5、0.2、0.1mL，将其分别放置于量瓶中（10mL），结合高效液相色谱法，纵坐标以峰面积，横坐标为样品进样量，绘制标准曲线。接着，制备供试品溶液。取10g巴豆、乙醚索氏提取去油打粉，药渣采用乙醇回流进行提取，结合过微孔滤膜，可得供试品。最后。进行正交试验设计。依据预试验显示结果，取乙醇体积分数、料液比、提取次数以及提取时间这四个因素，每因素择取3个水平，进行正交试验。
1.2.2 巴豆苷大孔树脂纯化工艺。取500g巴豆种子药材，提取乙醚索氏3h，作去油处理，药渣采用8倍量、浓度为20％的乙醇，回流连续提取3次后过滤，将提取液进行合并，回收溶剂后浓缩，使其为1.5g•mL－1，可得巴豆苷提取液。按照预试验显示结果，经由泄露曲线，结合已处理的D101型大孔树脂，明确上样药材用量与树脂比纯化效果，加入制备的提取液，调整上样液流速，用浓度为2％的乙醇进行冲洗，并合并冲洗液。经由纯度测定，提取液样纯化前巴豆苷质量分数，以甲醇-水为流动相，采用甲醇-水体系，分析巴豆苷分离状况以及出峰时间，选取合适上样量。
2 结果
经由上述参数设定后，以巴豆苷含量计，经由上样量分离后，观察峰形变化，发现上样量在20mg以上时，分离度呈下降趋势，而样品纯度将会出现下降，故巴豆苷＞20mg的溶液相对较好，流动相甲醇-水设定为7∶93，且流速在20mL•min－1，可得出制备液相图谱。予以巴豆苷回收溶剂真空干燥处理，结合HPLC检测法，取巴豆苷粉末进行测验检测，其纯度为98％时，总得率达51％左右。
3 结论
巴豆生物碱药理活性显著，临床上用于胃癌治疗已经取得了较为显著疗效，能改变蛋白质空间结构构象，促进人胄癌细胞SGC-7901死亡。同时，可阻滞HL-60细胞生成,诱发细胞分化，增强HI-60细胞NBT还原能力明显，有望成为白血病临床治疗诱发分化剂。在现阶段，对巴豆生物碱药学研究较少,一般先进行预试验,分析其溶解性质后，结合当前分离纯化技术，进行提取。据相关文献报道显示，小量巴豆作去油处理后，使用160倍量水，对巴豆苷含量进行测定，效果往往不佳[2]。究其根源，使用此种方法由于水溶性杂质相对较多，且回收较为困难，样品极其容易出现变质等现象，不易制取高纯度巴豆苷实验样品[3]。本文研究显示，采用正交设计，选用8倍量、浓度为20％的乙醇进行回流提取，总提取次数为3次,每次持续40min，可从根本上优化巴豆苷提取工艺参数，进而择取低体积分数的乙醇提取物，当流动相甲醇-水设定为7∶93，流速为20mL•min－1，且巴豆苷在20mg以上时，效果最优，可进行液相图谱的制备，最大限度地避免上述一系列的问题。从本质上来讲，采用DEAE纤维素，树脂前处理较为繁琐，且缓冲盐使用要求极为严格，纯化效果往往不佳。此外，DEAE纤维素成本高，与D101型大孔树脂相比，是其的几十倍，且再生繁琐。经由大孔树脂纯化，可提取高纯度巴豆苷。另外，制备液相可优化分离巴豆苷，予以HPLC检测后，可取纯度高达98％的巴豆苷单体，操作方法异常简单，同时分离效率相对较高，制取的产品质量优越，一定程度上有助于巴豆苷的制备，对于进一步开展巴豆苷药理研究起着举足轻重的作用。
综上所述，为了最大限度地纯化巴豆苷的纯度,必须要优化大孔树脂选择，严格筛选不同种类的大孔树脂，纯化大孔树脂，保证其在吸附率与解析率等方面的优势，综合考察洗脱剂、上样量等影响因素,结合巴豆苷对照品标准曲线，从而从根本上优化巴豆苷纯化条件，构建高效液相色谱条件，优化工艺参数，分析巴豆苷分离状况，得出最优出峰时间，可制取高纯度巴豆苷实验样品，一定程度上提升了巴豆药材质量标准。
参考文献
[1] 林彦君,傅超美,章津铭等.基于不同剂量比的巴豆配伍桔梗“减毒”作用机制探讨[J].中国实验方剂学杂志,2011（13）:178-181
[2] 李生梅,曾宝,黄孟秋等.巴豆中巴豆苷的提取纯化及制备[J].中国实验方剂学杂志,2012（06）:21-24
[3] 曾宝,黄孟秋,唐君苹等.巴豆炮制新工艺及其生品与炮制品的对比研究[J].中药材,2012（03）:371-375