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阻塞性睡眠呼吸暂停综合症(obstructive sleep apnea,OSA)是睡眠时上气道反复塌陷引起的以反复微觉醒和间歇性低氧为特征的睡眠障碍性疾病。非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以肝脏甘油三酯积累的一种常见慢性肝病,并与胰岛素抵抗、2型糖尿病等密切相关。慢性间歇性低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)是OSA重要的病理生理特征,是参与NAFLD发生和发展的重要危险因素。既往研究多关注缺氧诱导因子与NAFLD的关系,而CIH诱导细胞稳态失衡是否参与NAFLD的发生和发展尚不明确。自噬是细胞对应激的适应性反应,基础水平的自噬维持了细胞老化和/或受损细胞器的生理周转,而自噬失调则促进细胞损伤。自噬在NAFLD的发病机制中的作用存在争议,同时在不同的组织器官中CIH诱导自噬对细胞的生存利弊也是不一致。因此,本课题从细胞稳态角度探究CIH诱导自噬失调是否参与NAFLD的发生和发展。目的:探索CIH诱导肝细胞自噬失调与NAFLD发生和发展的关系,以及自噬失调如何导致肝脏胰岛素抵抗的分子机制。方法:1、细胞实验:1)选择小鼠肝原代细胞和AML12细胞两种细胞系作为研究对象,予以慢性间歇性低氧处理,检测自噬相关蛋白(LC3B/LC3A、p62)的表达,内质网应激相关蛋白(ATF6、IRE1α、p-IRE1α、XBP1、e IF2α、p-e IF2α)的表达,脂肪合成相关基因SCD-1的表达。2)利用油酸(oleic acid,OA)刺激肝原代细胞进行CIH处理,检测GSH、SOD的活性及MDA的表达,同时检查MFN2蛋白的表达。2、动物实验:(1)肝脏脂代谢研究:将6周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为三:常氧组、CIH组和CIH+CQ组。检测小鼠体重、肝脏重量,血清甘油三脂(TG)、胆固醇(TC)的变化,血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的变化。通过HE染色、油红-O-染色、Masson染色分别观察肝脏炎性细胞浸润、脂质沉积以及窦周纤维化,检测促炎因子m RNA的表达,通过透射电镜观察肝细胞脂滴分布、细胞亚显微结构的变化。进一步通过免疫印迹等方法检测各组内质网应激相关蛋白、自噬相关蛋白、凋亡蛋白、脂质合成相关蛋白的变化。(2)肝脏胰岛素抵抗研究:将6周龄雄性C57BL/6J小鼠进行适应性喂养一周后,分别予以高脂饮食(HFD)和正常饮食(CD)喂养12月后每组再随机分三组:常氧组,CIH处理组和和CIH+CQ处理组,检测各组小鼠血糖含量的变化,对高脂喂养的小鼠CIH暴露后进行胰岛素耐受实验(ITT),检测肝脏氧化应激标志物(HO-1、i NOS、NRF2)m RNA的表达。通过检测MFN2蛋白的表达和透射电镜观察线粒体内质网相关膜(MAMs)的变化。进一步检测Drp1、Cyto C蛋白的表达和透射电镜观察线粒体结构和分裂的变化。结果:1、细胞实验:1)肝原代细胞和AML12细胞经CIH处理后LC3B/A的比值明显增加,IH组内质网应激相关蛋白(IRE1a、p-IRE1a、ATF6)的表达出现不同程度的升高,与LC3B/A的比值成相关性。同时,脂肪合成相关基因SCD-1的表达较常氧组的表达明显升高,并且与LC3B/A比值的变化成相关性。2)肝原代细胞经过/未经过OA刺激后经IH暴露,GSH、SOD的活性较常氧组明显下降,MDA的升高,在OA刺激组中这种变化更加明显;肝原代细胞和LO2细胞IH暴露后MFN2蛋白表达明显增高。2、动物实验:(1)肝脏脂代谢研究:1)CIH组小鼠经CIH暴露后较正常小鼠肝重、肝重/体重的比率升高,血清TG、TC、ALT、AST升高;CIH+CQ组较CIH组小鼠血清TG、TC、ALT、AST明显下降,并且肝重/体重的比率下降。2)油红-O-染色示CIH组小鼠肝脏出现明显脂肪变性,透射电镜下见肝细胞脂滴数量增加,HE染色显示窦周炎性细胞浸润和肝损伤,促进促炎因子(TNF-α、IL-6、IL1-β)m RNA表达增高,而CIH+CQ组小鼠肝脏脂肪变性,肝细胞脂滴数量,促炎因子m RNA不同程度下降;而Msson染色显示三组小鼠肝细胞中均未出现明显纤维化。3)与对照组相比,CIH组肝细胞自噬相关蛋白(beclin-1、LC3B/LC3A)内质网应激相关蛋白(p-IRE1a/IRE1a、p-e IF2a/e IF2a、ATF6),凋亡蛋白(cleaved caspase-3/caspase-3),而CIH+CQ组自噬、内质网应激、凋亡蛋白表达较CIH组明显降低。CIH组肝脏脂质合成相关基因(FASn、ACC、SCD-1)表达增加,而CQ治疗后脂质合成相关基因表达降低。(2)肝脏胰岛素抵抗研究:1)CD和HFD小鼠经CIH暴露后血糖均出现明显升高,而CQ干预后血糖出现不同程度下降;在HFD+CIH组小鼠ITT实验显示明显的胰岛素抵抗。CD和HFD饮食小鼠经CIH暴露后肝脏氧化应激标志物(HO-1、i NOS、NRF2)的m RNA表达增高。2)CD和HFD小鼠经CIH暴露后肝细胞MFN2蛋白表达不同程度升高,透射电镜下发现MAMs富集明显,线粒体肿胀,线粒体嵴消失,而CQ治疗后MFN2蛋白表达下降,MAMs富集减轻,线粒体结构恢复。3)CD和HFD小鼠肝脏经CIH暴露后肝脏Drp1蛋白表达增高,Cyot C蛋白表达增高,透射电镜下见线粒体体积缩小,碎片化,线粒体肿胀,而在CQ治疗后Drp1和Cyot C蛋白表达降低,线粒体碎片化减轻,线粒体形态恢复。结论:1、CIH诱导肝细胞自噬失调,诱导肝细胞内质网应激;2、CIH诱导肝细胞自噬失调,促进肝脂质合成增加、肝脏脂质沉积和炎性浸润,促进肝脏脂肪变性;3、CIH诱导肝细胞自噬失调,促进线粒体内质网相关膜富集,线粒体过度分裂,诱导肝脏氧化应激,参与肝脏胰岛素抵抗。