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背景:低剪切应力诱导的内皮-间充质转化(Endothelial-mesenchymal transition,End MT)在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要作用,但其机制仍有待阐明。课题组的前期研究发现H2S的外源性供体NaHS显著抑制低剪切应力诱导的ApoE-/-小鼠As斑块形成以及MEST表达,而且内皮细胞特异性过表达MEST可促进血管内皮细胞发生内皮间质转化进而加剧As病变。对MEST基因结构进行生物信息学分析发现,MEST基因上游存在锌指转录因子NFIL3特异性的识别和结合位点,同时NFIL3的60、175、208位氨基酸为半胱氨酸残基,为H2S的潜在巯基化修饰位点。H2S能否巯基化修饰这些位点?对这位点的修饰是否影响MEST的表达和End MT以及As发生发展?这些问题值得深入探讨。目的:从H2S对NFIL3的巯基化修饰及对MEST表达的调控探索其在低剪切应力诱导的End MT和As中的作用。方法:1.ApoE-/-小鼠分为对照组和NaHS组,NaHS组小鼠经腹腔注射NaHS(H2S外源性供体,剂量为56μmol/kg/d),对照组则经腹腔注射等体积的PBS;两组均进行左颈总动脉局部结扎手术,结扎其颈内动脉、颈外动脉和枕动脉,高脂饮食喂养2周,安乐处死并取其颈动脉,采用H&E和油红O染色检测颈动脉中As病变;免疫荧光检测颈动脉中MEST表达水平;2.高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠分为对照组和内皮细胞特异性敲低MEST组(记为AAV-MEST-RNAi组),喂养16周时安乐处死并取材,采用免疫荧光检测小鼠主动脉MEST的蛋白表达水平;全自动生化分析仪检测小鼠血脂水平;体视显微镜观察、油红O染色检测小鼠主动脉的As斑块;H&E、油红O和Masson染色检测主动脉根部As斑块病理形态;免疫荧光观察主动脉根部斑块区域α-SMA、Vimentin、CD31、VE-Cadherin蛋白表达;3.HUVECs分两种处理形式:剪切应力处理(15dyn/cm~2(生理层流剪切应力)组和2dyn/cm~2(低剪切应力组))和低剪切应力+GYY4137(H2S供体缓释剂,200mmol/L预处理HUVECs24h)处理(2dyn/cm~2组和2dyn/cm~2+GYY4137组),采用Western blotting检测细胞NFIL3、MEST、N-Cadherin、α-SMA、CD31和VE-Cadherin蛋白表达,生物素开关法检测NFIL3的巯基化水平,CHIP-q PCR检测NFIL3与MEST DNA结合水平;4.HUVECs分别转染LV-MEST-RNAi和LV-NFIL3-RNAi后进行低剪切应力处理:分为NC+2dyn/cm~2组、LV-MEST-RNAi+2dyn/cm~2组和LV-NFIL3-RNAi+2dyn/cm~2组,Western blotting检测细胞NFIL3、MEST、v WF、CD31、FAP、Vimentin、α-SMA、N-Cadherin和Tie2蛋白表达;5.GYY4137(0、100、200、400mmol/L)预处理HUVECs24h后进行低剪切应力处理,免疫荧光检测NFIL3的核转位情况;6.双荧光素酶报告基因检测NFIL3三个半胱氨酸分别突变为丝氨酸后MEST DNA的启动子活性,以及生物素开关法检测NFIL3突变前后的巯基化水平。结果:1.对照组小鼠的左颈总动脉与右颈总动脉相比,油红O红染的斑块明显增多,MEST表达增多;NaHS组小鼠的左颈总动脉与对照组小鼠的左颈总动脉相比,油红O红染的斑块明显减少,MEST表达减少;2.与Control组相比,AAV-MEST-RNAi组MEST蛋白表达减少了61.42%(P<0.05);两组小鼠的体重以及血脂无明显差异;AAV-MEST-RNAi组小鼠主动脉As病变面积减少55.69%(P<0.05)和主动脉根部斑块面积减少55.56%(P<0.01),As斑块中脂质蓄积减少,主动脉根部As斑块CD31和VE-Cadherin表达增多、Vimentin和α-SMA表达减少;3.与15dyn/cm~2组相比,2dyn/cm~2组HUVECs的NFIL3蛋白增加931.31%(P<0.01),添加GYY4137(200μmol/L)预处理后,MEST蛋白下调64.26%(P<0.01),NFIL3蛋白表达水平无明显改变,但其巯基化水平上调99.68%(P<0.01),内皮细胞标志物CD31、VE-Cadherin表达分别增加34%(P<0.01)和102.20%(P<0.05),间充质细胞标志物N-Cadherin和α-SMA表达分别减少76.47%(P<0.001)和48.40%(P<0.001);4.Lv-MEST-RNAi成功转染HUVECs,筛选MEST敲低效果最好的一组进行下一步实验;与NC+2dyn/cm~2组相比,LV-MEST-RNAi+2dyn/cm~2组的CD31、v WF和Tie2蛋白表达分别增加149.6%(P<0.05)、70.62%(P<0.05)和156.00%(P<0.05),FAP、Vimentin和N-Cadherin蛋白表达分别减少49.52%(P<0.01)、32.70%(P<0.05)和55.40%(P<0.05);Lv-NFIL3-RNAi成功转染HUVECs,筛选NFIL3敲低效果最好的一组进行下一步实验;与NC+2dyn/cm~2组相比,LV-NFIL3-RNAi+2dyn/cm~2组的NFIL3、MEST、FAP、Vimentin、α-SMA和N-Cadherin蛋白表达分别减少42.97%(P<0.05)、49.36%(P<0.01)、70.03%(P<0.01)、70.53%(P<0.05)、44.59%(P<0.05)和45.16%(P<0.05),v WF、Tie2蛋白表达分别增加81.07%(P<0.05)和186.40%(P<0.05);5.与0μΜ+2dyn/cm~2组相比,各组NFIL3都集中表达于核内,因此H2S不影响NFIL3的核转位;6.(1)与MESTp+空载对照组相比,MESTp+NFIL3-WT组MEST启动子活性上调390.10%(P<0.001);与MESTp+NFIL3-WT组相比,MESTp+NFIL3-WT+GYY组MEST启动子活性下调92.21%(P<0.01),MESTp+NFIL3-C60S组、MESTp+NFIL3-C175S组和MESTp+NFIL3-C208S组MEST启动子活性无明显变化;(2)与MESTp+NFIL3-WT+GYY组,MESTp+NFIL3-C60S+GYY组MEST启动子活性无明显变化,MESTp+NFIL3-C175S+GYY组和MESTp+NFIL3-C208S+GYY组MEST启动子活性分别上调86.85%(P<0.05)和96.87%(P<0.01);(3)与对照组相比,野生型和突变型NFIL3的巯基化水平分别上调51.18%(P<0.01)、45.46%(P<0.01)、89.03%(P<0.01)和74.60%(P<0.01)。结论:H2S通过巯基化修饰NFIL3抑制MEST转录,进而抑制低剪切应力诱导的End MT和As。