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目的:二氧化硅(SiO2)颗粒是生产环境中常见的职业性有害因素,对职业暴露者的健康构成巨大威胁。研究指出,SiO2颗粒暴露导致肺组织炎症、氧化应激及脂质过氧化,持续性的损伤及组织不良修复会进一步导致肺纤维化,甚至发展成为矽肺。虽然矽肺纤维化不可逆转,而早期的炎症反应和组织损伤却可以被有效干预,这对抑制矽肺的进展具有深刻意义。信号传导与转录激活因子6(signal transducer and activator of transcription 6,STAT6)除调控机体免疫反应外,还被发现可以抑制氧化应激缓解组织及效应细胞损伤,然而其具体机制有待进一步阐明。研究表明脂质过氧化是导致铁死亡的重要原因,且大量研究证实在多种因素诱导的急性肺损伤中发生铁死亡,抑制铁死亡可以缓解组织损伤。本课题将从铁死亡的角度,研究核转录因子STAT6在SiO2颗粒暴露所致肺损伤中的作用及潜在调控机制。方法:动物实验1.建立并评估小鼠肺损伤模型:将C57BL/6小鼠随机分为两组(6只/组):对照组(Ctrl)和SiO2颗粒暴露组(CS)。以非暴露式气管灌注(一次)的方式给予对照组小鼠50μl生理盐水,给予SiO2颗粒暴露组小鼠50μl SiO2颗粒混悬液(3mg/50μl)。造模一周后记录小鼠体重,收取各组小鼠肺组织并记录其重量,处理后行H&E染色。通过BCA试剂盒及qRT-PCR检测小鼠肺泡灌洗液蛋白含量及炎性细胞因子TNF-α、IL-6水平,评估肺组织损伤情况。2.采用相应试剂盒检测小鼠肺组织中MDA、铁含量、GSH含量,qRT-PCR检测小鼠肺组织中铁死亡相关基因Ptgs-2的mRNA表达水平,免疫组化检测小鼠肺组织中PTGS-2蛋白水平,评价肺组织铁死亡相关指标变化情况。3.建立损伤干预模型:将C57BL/6小鼠随机分为两组(6只/组):SiO2颗粒暴露组(CS)和去铁胺(Deferoxamine,DFO)干预组(CS+DFO)。对于 DFO干预组,小鼠在灌注SiO2颗粒混悬液苏醒恢复后经鼻滴DFO(50μl,10mg/kg),此后每天鼻滴一次。一周后检测各组小鼠肺损伤及铁死亡相关指标变化情况,评价铁死亡在此过程中的作用。4.通过qRT-PCR、Western Blot、免疫组化及核质分离检测小鼠肺组织中STAT6信号通路活化情况。5.通过生物信息学方法对公共数据库中的相关数据进行分析,揭示SiO2颗粒暴露过程中铁死亡和STAT6信号通路变化情况。6.利用Stat6基因敲除小鼠建立肺损伤模型(造模方式如前述)。造模结束后记录各组小鼠体重、肺重;收集并检测小鼠肺泡灌洗液蛋白含量(BCA试剂盒);通过H&E染色对小鼠肺组织进行病理结构学观察分析;通过免疫组化检测小鼠肺组织4-HNE水平;采用相应的试剂盒对小鼠肺组织中MDA、铁含量、GSH含量进行检测;通过qRT-PCR检测小鼠肺组织中Stat6、Ptgs-2、Slc7a11的mRNA表达水平;通过Western Blot检测小鼠肺组织中STAT6、PTGS-2、SLC7A11的蛋白水平,评价STAT6在小鼠肺损伤和铁死亡中的作用。7.应用生物信息学方法对STAT6与铁死亡进行相关性分析。细胞实验1.细胞SiO2颗粒暴露模型建立:将人单核细胞白血病细胞系THP-1接种于100mm的培养皿中,给予THP-1细胞PMA(5ng/ml)处理使其分化贴壁。培养24小时后给予细胞SiO2颗粒混悬液(100μg/ml)。继续培养24小时后收集培养上清液(CS medium),离心分装后用于处理HBE细胞。2.在HBE细胞中采用shRNA沉默STAT6基因或转染STAT6质粒调控细胞STAT6基因表达并给予细胞相应刺激(Erastin、RSL3、CS medium)。通过MTT实验检测分析细胞活性;采用相应的试剂盒检测细胞中MDA、铁含量、GSH含量;通过免疫荧光检测细胞PTGS-2蛋白表达;采用qRT-PCR检测HBE 细胞中STAT6、PTGS-2、SLC7A11的 mRNA 表达水平;采用 Western Blot检测细胞中STAT6、PTGS-2、SLC7A11的蛋白表达,在细胞水平上评价STAT6对铁死亡的作用。3.利用生物信息学方法(PPI蛋白网络互作分析、差异基因分析、KEGG分析等)寻找STAT6调控铁死亡的可能信号通路。4.在HBE细胞中转染P53和STAT6,给予CS medium刺激后,检测细胞活性(MTT法);采用相应试剂盒检测细胞LDH释放水平、MDA、铁含量、GSH含量;免疫荧光检测细胞PTGS-2蛋白表达,评价P53对细胞铁死亡的影响及STAT6的调控作用。5.在HBE细胞中转染P53或STAT6,通过免疫沉淀检测二者的相互作用关系;通过细胞核质分离和免疫荧光检测二者在细胞中的分布情况。调控HBE细胞STAT6基因表达,通过qRT-PCR检测P53,P21,SLC7A11的mRNA表达水平;通过免疫沉淀分析STAT6对P53蛋白乙酰化的调控作用。6.在 HBE 细胞中沉默 CBP(CREB binding protein)基因,给予细胞 CS medium和LPS处理后,检测细胞中P53信号通路及其乙酰化水平,评价CBP对P53的作用。7.在HBE细胞中按不同组合转染CBP,STAT6,P53,通过免疫沉淀、免疫荧光、双萤光素酶报告基因、免疫共沉淀等方式检测STAT6与CBP的关系及其对P53乙酰化的作用和对P53/SLC7A11的调控机制。结果:1.SiO2颗粒暴露后,小鼠肺组织脏器系数比增加;CS组小鼠的肺组织H&E染色可见肺间隔增厚和大量炎性细胞浸润;CS组小鼠肺泡灌洗液蛋白含量和炎性细胞因子水平较Ctrl组增加。2.SiO2颗粒暴露后小鼠肺组织中铁死亡相关指标发生变化:与Ctrl组相比,CS组小鼠肺组织中MDA、铁含量增加,PTGS-2表达增高,GSH含量降低。3.DFO干预实验显示,与CS组相比,DFO+CS组小鼠肺组织损伤减轻,铁死亡被抑制。4.qRT-PCR、Western Blot、免疫组化及核质分离检测结果显示CS组小鼠肺组织中STAT6信号通路被激活。5.生物信息学分析结果显示铁死亡的标志基因和STAT6正向调控基因富集在SiO2颗粒暴露组。6.Stat6基因敲除小鼠在SiO2颗粒暴露后其肺损伤和铁死亡比野生型小鼠严重。生物信息学分析显示铁死亡相关基因富集在STAT6低表达组。7.干扰HBE细胞STAT6基因表达促进Erastin、RSL3、CS medium诱导的细胞铁死亡;过表达STAT6抑制细胞铁死亡。8.生物信息学分析结果提示STAT6可能通过负性调控P53/SLC7A11抑制铁死亡。9.上调P53促进SiO2颗粒暴露所致HBE细胞铁死亡;过表达STAT6后,P53促进SiO2颗粒暴露所致细胞铁死亡的作用被抑制。10.免疫沉淀、核质分离、免疫荧光等实验结果表明STAT6与P53没有直接相互作用且不会影响P53在细胞中的分布。11.调控HBE细胞STAT6基因表达,P53蛋白水平无明显变化但其乙酰化水平与STAT6的蛋白水平呈负相关。12.上调P53乙酰化促进HBE细胞铁死亡,沉默CBP基因可以抑制P53乙酰化,抑制细胞铁死亡。13.在HBE细胞中按不同组合转染STAT6,CBP和P53,免疫沉淀结果显示STAT6和P53均可以与CBP结合形成免疫复合物,且过表达STAT6竞争性结合CBP,减少P53与CBP的结合,降低P53对SLC7A11蛋白表达的抑制。14.双萤光素酶报告基因和免疫共沉淀结果提示过表达STAT6使SLC7A11基因的转录活性增加,沉默细胞CBP基因降低P53对SLC7A11基因转录活性的抑制作用。结论:1.SiO2颗粒暴露导致肺损伤的过程中发生铁死亡,抑制铁死亡可以缓解SiO2颗粒暴露所致肺损伤。2.Stat6基因敲除促进铁死亡,加重SiO2颗粒暴露所致肺组织损伤。3.STAT6竞争性结合CBP,抑制P53乙酰化,减弱P53对SLC7A11基因转录的抑制作用,下调铁死亡。