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目的:鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii,AB）是革兰阴性机会致病菌,医院感染的重要病原菌。其耐药性日益严重,特别是耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌（Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii,CRAB）,几乎对所有种类的抗生素表现出广泛的耐药性,给临床治疗带来了极大的困难。世界卫生组织（World health organization,WHO）将其归为最需关注的级别。因此,深入了解CRAB的分子流行病学特征,对于临床感染的治疗和防控具有重要意义。近年来更是出现了高毒高耐鲍曼不动杆菌（Carbapenem-resistant hypervirulent A.baumannii,CR-hvAB）,凭借致病力强,耐药率高,临床预后差等特点引起了临床广泛的关注。在肺炎克雷伯菌中高粘表型往往和高毒表型相关,而在鲍曼不动杆菌中,两种表型之间的相关性研究较少,因此本研究将着重探究CRAB中粘液型菌落的耐药性、毒力以及粘液产生的机制,以期更好的认识CR-hvAB。方法:1、实验菌株及相关临床信息收集:为了更好的跨时空比对研究,收集2010年6月至2013年6月以及2019年10月至2020年9月苏州市某三级甲等中医院临床分离的CRAB非重复分离株。2、菌种鉴定与药敏试验:通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪（Matrix-assisted Laser Desorption ionization-time-of-flight Mass Spectrometer,MALDI-TOFMS）对所收集到的细菌进行鉴定,同时通过聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）以及 Sanger 测序比对菌株的 16S rRNA。使用Phoenix-100（BD）全自动微生物分析仪以及仪器配套药敏纸片测定细菌对临床常见药物的最低抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration,MIC）,药敏结果参照2021 年美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）标准进行判读,再通过纸片法（K-B法）复核亚胺培南和美罗培南药敏。3、碳青霉烯酶表型试验:通过改良Hodge试验,判断菌株是否产碳青霉烯酶。4、β-内酰胺酶基因检测:通过PCR检测菌株中编码超广谱β-内酰胺酶基因（blaCTX、blaTEM、blaSHV）以及碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-23）,阳性产物进一步通过Sanger测序鉴定。5、毒力基因检测:通过PCR检测编码菌株生物膜形成（csuE、pgaB）、铁摄取系统（basJ）、荚膜多糖合成（ptk）、双组分调节系统（bfmS）和脂多糖（lpsB）6个毒力基因,阳性产物进一步通过Sanger测序鉴定。6、同源性分析:通过脉冲场凝胶电泳（Pulsed field gel electrophoresis,PFGE）技术对所收集的菌株进行检测,并使用GelJ2.0软件对结果进行分析。7、药敏试验:将88株菌株中发现的5株拉丝试验阳性的粘液型菌株定义为实验组,另随机选取5株拉丝试验阴性的非粘液型菌株设为对照组。采用微量肉汤稀释法（Broth microdilution method,BMD）分别测定多粘菌素B和美罗培南对两组菌株的MIC。8、生物膜测定:通过结晶紫染色分别测定两组菌株的生物膜形成能力（Biofilm information）。9、糖醛酸定量试验:使用四硼酸钠/浓硫酸对糖醛酸进行水解,水解产物能够与3-羟基二苯酚反应产生粉色衍生物,且该物质在520 nm处的吸光度与糖醛酸量成线性关系。因此通过该方法可以分别测定两组菌株的糖醛酸含量。10、大蜡螟体内毒力试验:用粘液型菌株、非粘液型菌株,生理盐水,分别感染大蜡螟,连续观察三天,记录不同组大蜡螟存活情况,绘制生存曲线,判断粘液型菌株对大蜡螟模型的毒力强弱。11、多糖检测:提取鲍曼不动杆菌多糖,将制备好的多糖进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）,并用阿尔新蓝染色。12、鲍曼不动杆菌粘液表型调控基因转录水平检测:通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,RT-PCR）对pgaB基因的转录水平进行检测。结果:1、本次研究共收集到CRAB菌株88株,其中2010年6月至2013年6月共71株,2019年10月至2020年9月共17株。其中检出率最高的部位是痰液82株,其他部位包含尿液、脑脊液、胸水、脓液共6株。病原菌检出量从多到少的科室依次是ICU、肺病科、神经外科、神经内科、骨科和急诊科。2、本次研究的88株CRAB有23株碳青霉烯酶表型实验阳性;88株菌株全部携带blaOXA-23基因,其中60株（68.2%）携带blaTEM基因,其余6个耐药基因（blaCTX、blaSHV、blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP）均未检出。CRAB 对抗生素大类的耐药率均＞70%,相隔9年的两组菌株的耐药率有明显不同,对头孢哌酮/舒巴坦和氨苄西林/舒巴坦的耐药率从2010年的77%和50%上升到了 2019年的均为100%;而对复方磺胺甲噁唑的耐药率却从2010年的100%下降到2019年的18%。3、6种毒力基因除csuE检出率为95.5%外,其余5种毒力基因（pgaB、basJ、ptk、bfmS、lpsB）的检出率都是100%。4、PFGE聚类分析将88株鲍曼不动杆菌共分成3个克隆型,其中C1克隆型由2019年12月份神经外科的两株细菌组成。而C2（18株）和C3（68株）在不同年份的菌株中都有发现,C3为最主要的克隆型。5、粘液组对美罗培南和多粘菌素B的MIC与对照组相比,均无统计学意义（P＞0.05）。6、在生物膜形成试验中,粘液鲍曼不动杆菌和对照组之间未观察到显著差异（P＞0.05）。7、在糖醛酸定量试验中,粘液型鲍曼不动杆菌的含量明显高于对照组（P＜0.05）,有统计学意义。8、粘液组感染大蜡螟幼虫的生存率和对照组相比未发现显著差异（P＞0.05）。9、我们通过SDS-PAGE将两组细菌的多糖分离并用阿尔新蓝染色之后,在粘液组菌株中,检测到2个主要谱带,命名为带1带2,带1与细菌荚膜多糖有着一致的迁移模式;带2代表另外的高分子量多糖。可以看到粘液组有带1和带2,而对照组和标准菌株ATCC19606只有较为宽大的带1,表明粘液菌株产生了较多的高分子量多糖,而对照菌株没有。10、实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,粘液组pgaB基因的转录水平明显高于对照组。结论:1、该三级甲等中医院CRAB的分布及耐药情况与国内大部分其他三级综合性医院相似。CRAB对头孢哌酮/舒巴坦、氨苄西林/舒巴坦的耐药率从2010年到2019年出现了明显的上升,提示该院需要控制这两种抗生素的合理使用。2、CRAB同源性分析结果显示C2克隆型和C3克隆型从2010年开始就在该院ICU、神经外科、神经内科、肺病科四个科室播散传播,而C1克隆型是2019年发现的新的克隆型,提示院感部门要加强对对相关科室环境的消杀,积极预防和控制CRAB在院内的传播,尤其要警惕新的克隆型在医院的传播。3、粘液菌株生产出了大量的不依赖于K基因座的高分子量多糖取代了荚膜多糖,并且在粘液菌株中检测到了编码聚-N-乙酰基-葡糖胺（Poly-N-acetyl-glucosamine,PNAG）的pgaB基因的表达显著上调,这可能是CRAB产生粘液表型的一个重要原因。