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人胰腺导管腺癌(PDAC)是已知最致命的癌症之一,5年生存率小于7%。由于人胰腺导管腺癌早期临床症状不明显,且不易诊断,因此确诊时往往已至晚期。目前外科手术联合放射治疗和化疗仍是针对人胰腺导管腺癌最有效的治疗手段,但不良反应明显。因此寻找新的治疗方法迫在眉睫。文献调研表明,硫化氢(H2S)广泛参与心血管系统、神经系统、呼吸系统,且与肿瘤发生发展关系密切。H2S的生物合成主要来源于三种酶:胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)、胱硫醚-β-合成酶(CBS)、3-巯基丙酮酸硫转移酶(MPST)。三种内源性硫化氢合成酶在多种肿瘤细胞中存在高表达,由此产生的H2S有助于维持肿瘤细胞的生物能量并促进肿瘤内血管生成。抑制肿瘤细胞内源性硫化氢合成酶后,伴随硫化氢含量降低,肿瘤细胞的增殖能力下降并发生凋亡。硫化氢的三种合成酶之间存在着一定的代偿作用,即抑制其中一种后,另外两种会有一定程度的表达升高以补充细胞内H2S水平。通过基因沉默手段同时抑制3种内源性硫化氢合成酶存在着诸多困难,但药理学抑制剂的联合使用目前可以同时使三种酶表达量降低,达到H2S水平显著下降的目的。本课题主要围绕H2S在人胰腺导管腺癌中生物学功能和分子机制进行研究,内容均为首次研究,所得结果将为胰腺癌的治疗和硫化氢与胰腺癌之间关系提供新的参考。本课题分别在体外与体内探究硫化氢合成酶抑制剂对胰腺癌细胞生长的抑制作用,并探究硫化氢合成酶抑制剂对胰腺癌细胞增殖、周期、横向及纵向迁移、侵袭、凋亡、线粒体功能的影响从而确定硫化氢合成酶抑制剂抑制胰腺癌细胞生长的药理机制。本课题首先通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验发现胰腺癌细胞中的内源性硫化氢合成酶水平均高于胰腺正常细胞。继而通过文献调研及CCK-8实验确定后续加药方案,进一步通过Elisa实验检测发现单独和联合使用PAG、AOAA、L-ASP都能降低胰腺癌细胞内H2S含量,其中联合加药作用最为显著。在对癌细胞作用中,MTT、CCK-8实验结果表明,三种药物单独及联合使用24小时都可显著促进癌细胞凋亡,其中联合加药效果最明显。Ed U实验结果表明抑制硫化氢后胰腺癌细胞增殖分裂过程受阻。流式细胞术检测细胞周期表明胰腺癌细胞被阻滞在S期。TUNEL、流式实验、凋亡蛋白相关western blot实验结果均表明联用抑制剂对胰腺癌细胞有十分明显的凋亡诱导作用。划痕实验和Transwell、Invasion实验及western blot结果表明,使用抑制剂后,胰腺癌细胞迁移侵袭能力下降,上皮间质转化过程被抑制。再次,western blot实验结果表明联合使用三种抑制剂可通过MAPK通路调控胰腺癌细胞的增殖及凋亡。活性氧(ROS)实验、线粒体膜电位(JC-1)实验、细胞能量变化(ATP)、乳酸脱氢酶活力(LDH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性、过氧化物酶(CAT)活力、脂质氧化水平(MDA)变化、铁死亡相关western blot实验结果显示,联用药物24h后胰腺癌细胞内脂质代谢受损、铁死亡发生、ROS显著升高、线粒体膜电位明显下降、ATP的生成被抑制。最终,本课题分别建立胰腺癌细胞Panc-1和Mia Pa Ca-2裸鼠皮下荷瘤模型,通过瘤旁注射给药观察效果。结果表明联合用药组肿瘤增长最为缓慢。肿瘤HE染色结果表明,PAG、AOAA、L-ASP均具备较好生物安全性,肿瘤的免疫组化结果显示实验组肿瘤ki67阳性率低于对照组,即实验组肿瘤生长受阻;实验组CD31阳性率低于对照组,即实验组肿瘤组织血管生成受阻;实验组肿瘤组织染色Cleaved caspase 3阳性率高于对照组,即实验组肿瘤凋亡水平上调;实验组P21阳性率高于对照组,即实验组肿瘤存在周期阻滞;实验组MMP-9阳性率低于对照组,即实验组肿瘤侵袭能力下降。另外对移植瘤组织标本进行Tunel染色,结果表明内源性硫化氢水平的下降可上调胰腺癌细胞凋亡水平。综合上述实验结果,体外实验表明,联合使用针对于内源性硫化氢合成酶CSE、CBS、MPST的药理学抑制剂PAG、AOAA、L-ASP可以通过调节MAPK通路使胰腺癌细胞增殖放缓、并调节凋亡相关蛋白(Cleaved caspase 3、BAD/Bcl-xl和Bax/Bcl-2)的表达,导致细胞周期阻滞于S期和细胞凋亡。胰腺癌细胞伴随着内源性H2S水平下降,同时发生迁移侵袭能力下降、上皮间质转化过程受阻、铁死亡进行。体内实验中,通过建立裸鼠皮下移植瘤模型发现PAG、AOAA、L-ASP除具备生物安全性外,可以在体内诱导肿瘤细胞肿瘤增殖放缓、阻滞周期、凋亡水平升高、血管生长能力下降、侵袭能力减弱,联合使用时效果最好。本论文为H2S在胰腺癌中的研究提供了基础,为胰腺癌的预防、治疗提供了新思路。