【摘 要】
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目的:研究PM2.5致人脐静脉内皮细胞内质网应激与铁死亡的分子机制,并探究大蒜素的保护作用,为科学评价大气PM2.5对心血管健康的风险提供基础科学数据,并为预防其潜在的健康风险提供新的思路与途径。方法:1.利用人脐静脉内皮细胞构建细胞模型,探讨PM2.5诱导HUVECs细胞发生内质网应激和铁死亡的机制。用浓度为0、1、5、25μg/m L的PM2.5处理HUVECs细胞,采用Western blo
【基金项目】
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国家自然科学基金（41877390）； 湖南省自然科学基金（2019JJ40241）； 有机地球化学国家重点实验室开放基金:（SKLOG202010）；
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目的:研究PM2.5致人脐静脉内皮细胞内质网应激与铁死亡的分子机制,并探究大蒜素的保护作用,为科学评价大气PM2.5对心血管健康的风险提供基础科学数据,并为预防其潜在的健康风险提供新的思路与途径。方法:1.利用人脐静脉内皮细胞构建细胞模型,探讨PM2.5诱导HUVECs细胞发生内质网应激和铁死亡的机制。用浓度为0、1、5、25μg/m L的PM2.5处理HUVECs细胞,采用Western blot技术在0、1、6、12、18、24 h 6个时间段检测内质网应激标志性蛋白IRE1α的表达,确定最佳的剂量和作用时间。随后在不同的PM2.5浓度下,检测细胞中内质网应激信号通路的PERK-e IFα-ATF4、IRE1α-XBP-1s和ATF6三种分支蛋白以及Ero1-Lα、Bip、CHOP、Cyto c和calnexin等蛋白表达水平,以探究PM2.5诱导HUVECs细胞产生内质网应激的机制。2.用浓度为28、56、112μg/m L的铁死亡抑制剂DFO分别与5μg/m L的PM2.5共同处理细胞,采用CCK8法测定细胞活力,确定铁死亡抑制剂DFO的最佳浓度。之后检测细胞内活性氧的释放水平、脂质代谢产物MDA的产量、线粒体膜电位、抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等）活力、抗氧化基因m RNA水平以及抗氧化蛋白水平,探讨PM2.5对细胞造成的脂质氧化应激损伤情况;通过实时荧光定量PCR技术检测铁死亡相关基因的表达水平,探究PM2.5是否诱导HUVECs细胞发生铁死亡。3.设计溶剂对照、PM2.5（5μg/m L）组、大蒜素（10μg/m L）组和大蒜素（10μg/m L）+PM2.5（5μg/m L）四组,通过多种抗氧化酶相关试剂盒、Western Blot和间接免疫荧光法等多种方法,研究大蒜素改善PM2.5致内皮细胞内质网应激和铁死亡的作用。结果:1.不同浓度PM2.5处理HUVECs细胞后,随着PM2.5浓度升高,PERK、e IFα、ATF4、IRE1α、XBP-1s和ATF6蛋白表达水平上升,同样的Ero1-Lα、Bip、CHOP、Cyto c和calnexin等相关蛋白表达水平也出现上调。而大蒜素干预后能够降低这些蛋白的表达水平,说明大蒜素可以逆转PM2.5对内皮细胞内质网应激的影响。2.在PM2.5暴露下,内皮细胞活性降低,ROS水平升高,触发了线粒体通透性转换孔的开放,MMP水平降低,并且PM2.5的暴露显著减少了细胞中CAT、SOD、GSH、Total GSH、GSH/Total GSH和GSH-Px等抗氧化酶的水平,降低抗氧化蛋白Nrf2的表达,而铁死亡相关基因LPCAT3、LOX12、ACSL4的表达水平升高,相应地SOD、CAT、GSH-PX、GSH/Total GSH抗氧化基因m RNA水平下降,而在铁死亡抑制剂DFO干预组中,细胞的活性升高,一系列的抗氧化酶和抗氧化蛋白水平升高,部分铁死亡基因表达下调,表明PM2.5可致内皮细胞铁死亡。且与PM2.5组相比,大蒜素干预组能够下调铁死亡相关基因的表达水平,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论:PM2.5可诱导人脐静脉内皮细胞发生内质网应激,并致其铁死亡,而大蒜素具有一定的改善作用。
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