【摘 要】
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目的:耐辐射奇球菌中的pprI、ddrO是两个重要辐射抗性基因。本课题旨在将pprI、ddrO基因分别转入大肠杆菌BL21,研究在辐射胁迫下pprI、ddrO基因对大肠杆菌的影响和机制,为表征pprI、ddrO的辐射抗性及构建高辐射抗性工程菌提供依据。方法:1.构建pET-23a-pprI-EGFP-HA、pET-23a-ddrO-m Cheery-flag荧光质粒,双酶切回收测序。将测序验证正确
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（导师何淑雅主持）:特殊辐射环境生物DR-pprM基因辐射应激防御机制研究（81741143）； 湖南省研究生科研创新项目（本人主持）:pprI、ddrO重组基因菌在放射抗性胁迫下的应激响应机制研究（QL20210233）；
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目的:耐辐射奇球菌中的pprI、ddrO是两个重要辐射抗性基因。本课题旨在将pprI、ddrO基因分别转入大肠杆菌BL21,研究在辐射胁迫下pprI、ddrO基因对大肠杆菌的影响和机制,为表征pprI、ddrO的辐射抗性及构建高辐射抗性工程菌提供依据。方法:1.构建pET-23a-pprI-EGFP-HA、pET-23a-ddrO-m Cheery-flag荧光质粒,双酶切回收测序。将测序验证正确的质粒转化入大肠杆菌感受态BL21（DE3）细胞中,使用含有氨苄的LB培养基筛选并增殖;2.利用Western-blotting、荧光显微镜验证pprI、ddrO基因的表达,采用涂板法和Hoechst法,检测在辐照处理后pprI/ddrO基因转化菌组、空载质粒组、未转化菌组在菌落数目、生长速度以及生存活性上的差异;3.通过137Cs-γ辐照（100Gy）处理pprI/ddrO基因转化菌组、空载质粒组、未转化对照菌组后继续以下实验:WST-8法检测SOD活力,微量酶标法检测CAT、ATP酶活力,比色法测定GSH含量;红外光谱法检测各组菌群活性基团变化情况;q RT-PCR检测基因转化组在辐射胁迫下SOS响应修复关键基因rec A和lex A m RNA的表达量以及pprI、ddrO等m RNA的表达量。结果:1.经Nde I与Xho I双酶切及测序结果验证,成功构建原核表达荧光质粒pET-23a-pprI-EGFP-HA、pET-23a-ddrO-m Cheery-flag质粒。用HA、flag标签抗体得出的Western blot结果联合荧光显微镜观察,结果表明,转基因大肠杆菌菌株E.coli-pprI能够表达Ppr I蛋白（荧光显微镜下呈绿色）,E.coli-ddrO能够表达Ddr O蛋白（荧光显微镜下呈红色）。2.137Cs-γ（100Gy）辐照处理后,转基因菌E.coli-pprI,E.coli-ddrO的菌落数目均大于未转化对照菌株及空载菌株的数目,且均具有统计学差异（P＜0.05）。未转化对照组较转pprI、ddrO基因菌的生长速度慢,且差异均具有统计学差异（P＜0.05）。用Hoechst法检测辐照对转基因菌生存活力的影响,pprI、ddrO基因转化组细菌存活率显著增加。3.137Cs-γ（100Gy）辐照处理后,WST法检测辐照对pprI/ddrO基因转化菌组SOD酶活力影响,微量酶标仪法测CAT、ATP酶活力的影响,比色法检测GSH含量的影响,未转化菌对照组与空质粒转化组相比,SOD、CAT、GSH、ATP水平无明显变化差异;与未转化菌对照组相比,pprI/ddrO基因转化菌组SOD、CAT、ATP酶活性水平增加（P＜0.05）,GSH含量增加（P＜0.05）,且均具有统计学差异;4.137Cs-γ（100Gy）辐照处理后,红外光谱数据显示pprI、ddrO基因转化菌后的细菌活性基团变化区域两者相同,提示可能主要通过蛋白胺基炔烃、蛋白胺基C-H键、蛋白酰胺I带N–H氨基、酰胺Ⅱ带中仲酰胺N-O键等活性基团的峰值增强,共同参与细菌对辐照损伤的抵抗。5.137Cs-γ（100Gy）辐照处理后,比较pprI/ddrO转化菌组辐照前后的pprI、ddrO的m RNA表达量,辐照会增加pprI、ddrO的m RNA生成量,且均具有统计学差异（P＜0.05）。pprI、ddrO与未转化组和空载组相比均能增加rec A基因表达（P＜0.05）,减少lex A基因表达（P＜0.05）,且均具有统计学差异。结论:1.成功构建两株转基因大肠杆菌菌株—E.coli-pprI（表达Ppr I蛋白）和E.coli-ddrO（表达Ddr O蛋白）;2.转基因大肠杆菌菌株E.coli-pprI、E.coli-ddrO的辐射抗性均高于未转化菌及空质粒转化菌;3.在辐照处理后,转基因大肠杆菌菌株E.coli-pprI和E.coli-ddrO有活性基团参与辐射响应;4.辐照可促进pprI、ddrO基因的m RNA应激表达;pprI、ddrO基因能通过增加rec A m RNA表达,减少lex A m RNA表达来增强工程菌经典SOS修复途径,提升大肠杆菌抗辐射能力。
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