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长牡蛎（Crassostrea gigas）是我国乃至世界重要的海水养殖品种。但是,近年来,病毒性疾病引起的大规模死亡给长牡蛎养殖产业造成重大损失。长牡蛎属于无脊椎动物,只能依靠天然免疫机制抵御病原微生物的侵害,因此对长牡蛎抗病毒天然免疫机制的解析显得尤为重要。RIG-I样受体（RIG-I like receptors,RLR）是定位于细胞质基质中一类关键的模式识别受体,可以识别各类病毒及其病原相关分子模式,并通过定位在线粒体膜上的线粒体抗病毒信号蛋白（Mitochondrial antiviral signaling,MAVS）传递免疫信号,并最终激活相应的转录因子,发挥抗病毒免疫效应。虽然在脊椎动物中已有较深入研究,但是在无脊椎动物中的研究开展的较少。本研究主要对长牡蛎RLR信号通路中的几个免疫基因进行鉴定及功能分析,结果如下:1.结合前期研究,对长牡蛎基因组中含CARD结构域的RLR基因进行克隆鉴定,在长牡蛎基因组中共发现5个含CARD结构域的RLR基因（命名为Cg RLR2-Cg RLR6）。这5个RLR均含有CARD结构域、DEXDc结构域、Helicase结构域和RD结构域。系统进化分析显示,脊椎动物的RIG-I,MDA5和LGP2先聚为一支,而贝类的RLR聚在一起,提示脊椎动物的RLRs可能由同一祖先分化而来,而无脊椎动物的RLRs之间也存在基因结构及功能方面的分化。实时荧光定量PCR实验结果表明,长牡蛎各RLR基因表达均受聚肌胞（Polyinosinic:polycytidylic acid,Poly（I:C））刺激的显著诱导。更重要的,免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation asssys,Co-IP）和酵母双杂交（yeast two hybrid,Y2H）实验结果显示,Cg RLR2,Cg RLR4和Cg RLR6的CARD结构域均能与下游接头分子Cg MAVS相互作用,而Cg RLR3和Cg RLR5的CARD结构域却不能结合Cg MAVS,这提示长牡蛎显著扩张的RLR家族基因已发生功能分化。2.在长牡蛎中鉴定了一个IKK家族基因并命名为Cg TBK1/IKKε,Cg TBK1/IKKε基因开放阅读框ORF为2259 bp,编码752个氨基酸,预测蛋白分子量约为86.4k Da。Cg TBK1/IKKε蛋白包含蛋白激酶催化结构域（protein kinase catalytic domain,PKc）和泛素样结构域（ubiquitin-like domain,Ubl）。实时荧光定量PCR实验检测发现,在所有组织中Cg TBK1/IKKε均有表达,且在血细胞中的表达能被脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和Poly（I:C）刺激诱导,提示Cg TBK1/IKKε可以响应细菌和病毒的刺激。此外,Cg TBK1/IKKε可与Cg MAVS和Cg My D88结合,表明其在长牡蛎RLR和TLR信号通路中发挥重要作用。Co-IP实验还表明Cg TBK1/IKKε与Cg TBK1及IKKε-like均存在相互作用,这说明它们可能以信号复合物的形式参与信号转导;最后,荧光素酶双报告基因实验结果显示Cg TBK1/IKKε可以抑制Cg IKKε-like对NF-κB和ISRE报告基因的激活作用,提示Cg TBK1/IKKε可能是Cg IKKε-like的负调控因子,在下游转录因子的激活中发挥着重要的调控作用。3.在长牡蛎中确定了一个IκB基因,命名为Cg IκB4,其ORF为1029 bp,编码342个氨基酸,预测蛋白分子量约为38.3 k Da。Cg IκB4蛋白含有四个典型的锚蛋白重复序列。实时荧光定量PCR结果显示,Cg IκB4在所有被测组织中均能表达,并且在唇瓣中表达水平最高,在性腺中表达水平最低。Cg IκB4 m RNA可以响应Poly（I:C）、LPS和肽聚糖（Peptidoglycan,PGN）的刺激。Co-IP实验结果显示,Cg IκB4可与Cg Rel1和Cg Rel2相互作用,这表明软体动物存在着保守的NF-κB-IκB相互调控关系;荧光素酶双报告基因检测结果显示,Cg IκB4可以抑制Cg Rel1对NF-κB和TNFα报告基因的激活作用,这表明Cg IκB4参与长牡蛎抗病毒免疫调节过程。综上所述,本研究进一步解析了RLR天然免疫信号通路在长牡蛎抗病毒免疫中的功能。对RLR信号通路上的模式识别受体（各RLR）、重要信号转导分子（TBK1/IKKε）及关键调控蛋白（IκB4）进行鉴定,并初步分析了在免疫信号传导中的生物学功能。实验结果表明这些基因均参与了长牡蛎RLR通路的信号传导过程并在长牡蛎天然免疫过程中发挥关键作用。这些研究结果不仅丰富了长牡蛎天然免疫理论,也为长牡蛎病害防治和抗病新品系选育提供理论参考,具有较高的应用价值。